Bitki Ekstraksiyonu Patojenlerinden Gen İfadesinin Tek Hücreli Analizi

Özet

Kaynak: Rufián, J. S. ve diğerleri. Bitki dokusunda Pseudomonas Syringae genlerinin tek hücreli analizi. J. Vis. Exp. (2022).

Bu video, floresan etiketlenmiş transkripsiyon faktörü kullanılarak bitkiden ekstra edilmiş patojenik bakterilerde gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Konfokal görüntüleme, virülans gen ifadesinde heterojenliği ortaya koyarak klonal bakteri popülasyonundaki fonksiyonel çeşitliliği ortaya koyuyor.

Protokol

1. Apoplast ekstraksiyonu olan bakterilerin tek hücreli analizi

1. Damıtılmış suda %1,5 agaroz çözeltisi hazırlayın. Eridikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopik slayt arasındaki boşluğu dolduracak kadar hacim ekleyin ve üzerine başka bir slayt yerleştirin (Şekil 1). 15 dakika kurumasına izin verin ve üstüne yerleştirilen sürgüyü dikkatlice çıkarın. Bir bıçak kullanarak, agarose pedini kullanmadan hemen önce 5 mm x 5 mm parçalara kesin.
2. Paralel olarak, apoplast ekstraksiyonu 12.000 x g sıcaklıkta oda sıcaklığında 1 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı pipet ile dikkatlice çıkarın ve pelleti hücreleri konsantre etmek için 20 μL suya yeniden süsleyin. Konsantre hücrelerden 2 μL damlasını 0,17 mm'lik bir kapak kılıfına yerleştirin ve damlayı, Şekil 1'de gösterildiği gibi, daha önce 1. adımda elde edilen 5 mm x 5 mm boyutlarında agaroz pediyle kaplayın.
3. Bakteri preparatını konfokal mikroskop altında görselleştirin ( bkz. Materyaller Tablosu). Yeşil-floresan bakterileri tanımlamak için, 488 nm'de uyarılma lazeri ve 500 nm'den 550 nm'e kadar değişen bir emisyon filtresi kullanın. Tüm bakterileri tanımlamak için parlak alanı kullanın ve her iki alanı birleştirin.
4. Konfokal görüntüleri Fiji ile işleyin (bkz. Materyal Tablosu). Bunu yapmak için, MicrobeJ eklentisini kullanarak bakteri hücresinin konturunu belirleyin ve içindeki floresans yoğunluğunu ölçün.
   NOT: Bu analiz için izole bakterilerden (kümelenmiş olmayan) görüntü alınması önerilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Agar pedinin ayarlanması ve hazırlanmasının şematik temsili.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.17 mm örtü kaydırması			Özel bir şart yok
1,6 x 1,6 mm metal ağ	Buzifu		Fiberglas ekran ağı
50 mL konik borular	Sarstedt
Agarose	Merk
Konfokal Mikroskop Stellaris	Leica Microsystems
Fiji yazılımı