1. Suşlar ve Kültür Koşulları
NOT: Sentetik ağız topluluğu, ağız mikrobiyomunda yaygın olarak bulunan suşlardan oluşuyordu.
- Amerikan Tip Kültürü Koleksiyonu'ndan (ATCC) aşağıdaki suşları elde edinin: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) ve Streptococcus mitis (ATCC 49456).
- Leibniz Enstitüsü DSMZ-Alman Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan Veillonella parvula edinin (DSM 2007), BCCM/LMG Bakteri Koleksiyonu'ndan Streptococcus sanguinis (LMG 14657) ve Streptococcus salivarius suşu TOVE-R ile Streptococcus oralis'i kullanın.
2. Ağız Mikrobiyomun Çok Türlü Bir Topluluk Temsilcisinin Geliştirilmesi
NOT: Ağız bakterilerinin in vitro bağırsak epiteline potansiyel yapışma kapasitesini simüle etmek için sentetik bir topluluk oluşturmak. 5 μg/mL hemin, 1 μg/mL menadion ve %5 steril defibrinasyonlu at kanı takviyesi olan kan agar plakalarında bakteri yetiştirmek. Kısaca:
- 100 mg hemin'i 2 mL 1 M sodyum hidroksit (NaOH) içinde çözün ve 100 mL damıtılmış otoklav su ekleyin. Koyu bir kapta sakla. Malzemeye eklemeden önce 0.22 μm filtreyle sterilize edin.
- 100 mg menadionu, %96 etanolden oluşan 20 mL içinde çözün. Malzemeye eklemeden önce 0.22 μm filtreyle sterilize edin.
- Üreticinin talimatlarına ve otoklavına göre 1 L kan agar ortamı (bkz. Malzeme Tablosu) hazırlayın. At kanı ve takviyeleri eklemeden önce soğumasına izin verin. Tabakları karıştırıp dök.
- Modifiye edilmiş Beyin Kalp İnfuzyonu (BHI) çorbası hazırlayın. Otoklavlamadan sonra 5 μg/mL hemin ve 1 μg/mL menadion ekleyin.
- Hungate tüplerinde 9 mL ortam dağıtın ve kauçuk stoper ile alüminyum kapakla kapatın. Tüpleri azot/karbondioksit veya N2/CO2 (%90/%10) ile yıkayın.
- 1 mL anaerobik ortamı bir şırıngayla alın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Her bakteri türünün tek kolonilerini seçin, ortamda yeniden süzülün ve anaerobik modifiye BHI'ya geri aktarın. 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın, S. salivarius hariç, 24 saat kuluçka yapılmalıdır.
- Gerekirse, sentetik topluluğu birleştirmeden önce kültürlerin saflığını doğrulayın. Kısaca:
- Sıvı kültürlerden DNA çıkarıp 27F (AGAGTTTGATYMTGCTCAG) ve 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT) primerleriyle 16S rRNA genini amplifikasyon ve aşağıdaki programı uygulayın: 95 °C'de 5 dakika, 1 dakika 95 °C'de 30 döngü, 1 dakika 55 °C ve 1,5 dakika 72 °C ile son uzatma adımı.
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürününü üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir kit ile ( bkz. Malzemeler Tablosu) arındırın.
- Saflaştırılmış ürünlerin dizileme reaksiyonunu, 0,5 μL boya içeren toplam 10 μL hacimde (bkz. Malzeme Tablosu), 3,2 pmol M13f primer (CGCCAGGGTTTCCCAGTCAGTCACGAC), 2,0 μL 5x dizileme tamponu ve 20 ng şablon içeren bir dizi yapı reaksiyasını, ticari bir dizileme sistemi ve kit kullanılarak gerçekleştirin ( bkz. Malzemeler Tablosu).
NOT: Bu işlemi ticari olarak yaptırdık. - Tüm dizilerde (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) BLAST araması yaparak en yakın bilinen taksonu belirleyin ve RDP Sınıflandırıcı çevrimiçi aracı (http://rdp.cme.msu.edu/) ile SINA Hizalama servisi (https://www.arb-silva.de/aligner/) kullanarak orijinal suşun dizisiyle karşılaştırın.
- Kuluçkanın sonunda hücre sayısını, akış sitometrisi ve SYBR Yeşil/Propidium İyodid boyama kullanarak ölçün. Kültürleri modifiye BHI kullanarak 105 hücrelik mL-1'e seyreltin.
- 75 mL anaerobik BHI'ye 1 mL S. mitis ekleyin ve durağan faza (6 saat) kadar kuluçka yapın. Sonrasında, her seyreltilmiş suştan 0,75 mL toplanıp anaerobik koşullarda karıştırın.
- Tüm kültürler karıştırıldıktan sonra, 1 ml mikrokozmos alın ve 75 mL BHI'ye ekleyin. Sentetik topluluğu %10CO2, %10 hidrojen (H2), %80 N altında, 48 saat boyunca 37 °C ve 200 devirde kuluçka yapın ( bkz. Malzeme Tablosu).
- Hücre yoğunluğunu 2.8'deki gibi ölçün. topluluğu hücre modeline sunmadan önce. Topluluk yapısı, nicel Gerçek Zamanlı PCR ile değerlendirilebilir. Ayrıca, mevcut ilk üyeler hakkında bilgi sağlamak için 16S rRNA gen amplikon dizileme kullanın. Her iki kimlik doğrulama protokolü için, proteinleri aktif olarak transkribe eden bakterileri göstermek için cDNA'yı şablon olarak kullanın ve suşların varlığını/yokluğunu ortaya çıkarmak için DNA'yı şablon olarak kullanın.
3. Genel Hücre Kültürü Uygulamaları
NOT: Avrupa Doğrulamalı Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan (Caco-2 ECACC 86010202 ve HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, İngiltere Halk Sağlığı, Birleşik Krallık) kullanılan hücre hatlarını alın. Hücre kültürü için reaktifler satın alınabilir ( bkz. Materyal Tablosu), aksi belirtilmedikçe.
- Caco-2 ve HT29-MTX hücre hatlarının bakımı ve geçişiNOT: Caco-2 ve HT29-MTX hücreleri, takviye edilmiş dulbecco modifiye kartal ortamı (DMEM) içeren 25cm 2 doku kültürü şişelerinde rutin olarak yetiştirilir (Tablo 1). Hücreler, %60–70 birleşime ulaşıldığında tripsize edilir.
- Termolardan hücre kültürü ortamını çıkarın. Kalsiyum/magnezyum içermeyen 5 mL PBS ile iki kez yıkayın (Ca++/Mg++).
- 2 mL 0,5 mg/L tripsin ve 0,22 g/L etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ekleyin. Tripsin çözeltisini şişeyi nazikçe hareket ettirerek dağıtın. 1,5 mL tripsin çözeltisi alın ve matayı 37 °C'de 10 dakika kuluçka edin.
- Mikroskop altında hücrelerin şişe yüzeyinden kopup kopmadığını kontrol edin. Gerekirse 5 dakika daha kuluçka yapın.
- Tripsini inaktive etmek için mataşa 5 mL takviye hücre kültürü ortamı ekleyin. Homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için pipet yapın.
- Hemerden, hücre süspansiyonundan 50 μL aliquot alın ve steril %0,4 Trypan mavisi çözeltisiyle Caco-2 hücreleri için 1:1 (v/v) oranında veya HT29-MTX için 1:5 v/v oranında karıştırın. Pipotle karıştırın ve sayma odasına yükleyin (bkz. Malzemeler Tablosu).
- Mikroskop altında canlı hücreleri (beyaz parlak hücreler) sayın (üreticinin talimatlarına bakınız).
- Caco-2 ve HT29-MTX için sırasıyla 4 x 105 hücre/cm2 ve 1 x 10 4 hücre/cm2 yoğunlukta yeni bir şişeye tohum ekin.
NOT: (1) Caco-2 hücreleri, birleşime ulaştıklarında farklılaşır ve sıkı birleşimler oluşturur. Tripsizasyondan önce aşırı konflensiya kaçınmak son derece önemlidir. Mataradaki hücrelerin aşırı büyümesi, tripsizasyon ve/veya hücre topaklanmasından sonra hücre ayrılmasında başarısızlık yaratabilir. (2) HT29-MTX hücreleri, yüksek metabolik aktiviteye sahip mukus üreten hücrelerdir. Bu özellikler, özellikle hücreler yüksek yoğunlukta ise, hücre kültür ortamının hızlı asitleşmesine neden olabilir. 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tamponu hücre kültür ortamına eklenebilir ve pH 7 ile 7.2 arasında tutulur. pH düşerse, birleşme %50'nin altında ortam değiştirilebilir. Ancak, birleşme %50 > ise hücre kültürü bölünmelidir.
4. Bağırsak konakçı-mikrob arayüzünü simüle eden çok bölmeli hücre modelinin montajı
NOT: Çift odalı kuyularda (çapı 24 mm, gözenek boyutu 0,4 μm; bkz. Malzemeler Tablosu) birlikte kültürü tamamlayın.
- Apikal bölmeye 1,5 mL tam hücre kültürü ortamı ve bazal bölüme 2 mL eklenin. Tohumlama sırasında hücre süspansiyonunun eşit dağılımı elde etmek için 20–30 dakika önceden kuluçka yapın.
- Caco-2 ve HT29-MTX hücre kültürünü bölüm 3'te tarif edildiği gibi tripsinize edin. Her iki hücre hattının homojen dağılımı için tripsizasyon prosedürünün doğru şekilde takip edilmesi gerekir; böylece tek bir hücre süspansiyonunda, kümeler olmadan homojen dağılım sağlanır.
- 3.1.8'de tanımlandığı şekilde canlı hücreleri sayın.
- Hücre yoğunluğunu Caco-2/HT29-MTX hücrelerinin 90/10 oranında 6,5 x 104 hücre/cm2 olarak ayarlayın.
- Hücre süspansiyonlarını homojenleştirin ve karşılık gelen Caco-2 ve HT29-MTX hücrelerinin hacmini, takviye hücre kültürü ortamıyla önceden doldurulmuş steril bir kaba ekleyin. Önceden kuluçka yapılan ortamı apikal taraftan aspirasyon yoluyla çıkarın.
- Hücre süspansiyonunu pipetle nazikçe karıştırın ve 1,5 mL'yi oda insertlerinin apikal bölmesine aktarın. Tohumlama prosedürü, hücrelerin tortu birikmesi nedeniyle hücre askısının sürekli homojenizasyonunu gerektirir. Kullanıcının deneyimine ve çalışma hızına bağlı olarak, hücre süspansiyonu 1–3 kuyu dağıtıldıktan sonra karıştırılmalıdır.
- Plakaları nazikçe geri ve öne doğru hareket ettirin, ardından sağdan soldan sağa (5–10 kez) hareket ettirerek hücrelerin eşit dağılımı elde edin. İnküçkaya aktarın ve plakaların hareketini tekrarlayın.
- Caco-2/HT29-MTX hücrelerinin birlikte kültürünü 15 gün boyunca sürdürmek, apikal ve bazal bölmeleri her 2 günde bir takviye edilmiş DMEM ile yenilemek. Bu süreden sonra, hücre kültürü ortamı antibiyotik/antimikotik çözelti olmadan takviyeli DMEM'e dönüştürülebilir.
- Sistemi tohumlamadan 20–21 gün sonra koruyun, ortamı her 2 günde bir yenileyin.
- Teste başlamadan önce, üreticinin talimatlarını takip ederek Elektrik Direnç Sistemi (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak epitel bariyerinin bütünlüğünü ölçün.
- Ölçümlere başlamadan önce transepitelyal elektrik direnci (TEER) ekipmanının tam olarak şarj olduğundan (>24 saat) emin olun.
- TEER ekipmanını güç kaynağından ayırın ve plastik bir otoklav torbası ile örtün. Elektrodu sokmak için torbada bir delik açın ve sayacın giriş portuna takın. TEER ekipmanını akış dolabına sokmadan önce %70 etanol/su (v/v) ile püskürtün.
- Elektrodu dezenfekte etmek için, elektrot uçlarını %70 etanol/su (v/v) bir çözeltiye 15 dakika boyunca batırın. 15 saniye hava kurumasına izin verin. Elektrodu önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamında durulayın.
- Hücreleri kuluçka makinesinden çıkarın ve hücrelerin akış dolabında oda sıcaklığına gelmesini sağlayın.
- Sayaçın şarj cihazından kopuk olduğundan emin olun. Mod anahtarını Ohm'a ayarlayın ve güç düğmesini açın.
- Elektrodu kısa ucu insertte, uzun ucu ise kuyunun dışına daldırarak hücre direncini ölçün. Elektrodu plaka girişine 90° açıyla tutun.
5. In vitro gastrointestinal transit koşulları sonrası bakteriyel hayatta kalma
NOT: Tüm seyreltmeleri ultra saf suyla hazırlayın. Tüm çözeltileri 0,22 μm filtreyle filtre sterilize edin ve sindirim işlemini steril koşullarda gerçekleştirin.
- Ağız sindirimi:
- Bakteri topluluğunun 3 mL'sini 50 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin, 3 mL simüle edilmiş tükürük sıvısı (SSF) ile karıştırın ve (mmol L-1 içinde): potasyum klorür (KCl), 15.1; potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4), 3.7; sodyum bikarbonat (NaHCO3), 6.8; magnezyum klorür heksahidrat [MgCl2(H2O)6], 0.5, amonyum karbonat [(NH4) CO3], 0.06; hidroklorik asit (HCl), 1.1; kalsiyum klorür dihidrat [CaCl2(H2O)2], 0.75. SSF'ye insan tükürüğü tip IX-A'dan 75 U/mL α-amilaza ve domuz midesi tip II'den 2 g/L müsin ekleyin.
- Karışımı 37 °C ve 100 rpm'de 2 dakika kuluçka edin. DNA çıkarımı ve akış sitometrisi (S1) niceliği için 2 mL bir örnek alın.
- Mide sindirimi:
- 4 mL simüle edilmiş mide sıvısı (SGF) ekleyin; bu sıvı mmol L-1 içinde: KCl, 6.9; KH2PO4, 0.9; NaHCO3, 25; sodyum klorür (NaCl), 47.2; MgCl2(H2O)6, 0.1; (NH4)CO3, 0.5; HCl, 15.6; CaCl2(H2O)2, 0.075. Ayrıca, SGF domuz midesi tip II'den 2 g/L müsin içeriyordu.
- pH ölçün ve gerekirse 1 M HCl ile pH 3'e ayarlayın. 37 °C ve 100 rpm'de kuluçka yapın. 2 mL (S2) bir örnek alın.
- İnce bağırsak sindirimi:
- 4 mL simüle edilmiş bağırsak sıvısı (SIF) ekleyin ve (mmol L-1 içinde): KCL, 6.8; KH2PO4, 0.8; NaHCO3, 85; NaCl, 38.4; MgCl2(H2O)6, 0,33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0.3, sindirim tüpüne.
- Gerekirse pH 7'ye ayarlayın ve gerekirse 1 M NaOH ile kullanın. 37 °C ve 100 rpm'de kuluçka yapın. 2 mL (S3) bir örnek alın.
6. In vitro gastrointestinal transit koşullarını takip eden bakteriyel kolonizasyon yeteneği
- 2 ml ince bağırsak sindirimini 10 dakika boyunca 2.650 x g ile santrifüj yapın.
- Üst maddeyi çıkarın ve bakteriyel pelleti antibiyotik ve antimikotiksiz 5 mL takviyeli DMEM ile karıştırın.
- Akış sitometresi kullanarak bozulmamış/hasarlı hücreleri boyantın ve nicelikle ölçüleyin ( bkz. Malzeme Tablosu).
- Hücre yoğunluğunu antibiyotik ve antimikotikler olmadan takviye edilmiş DMEM'de seyreltirerek 105 canlı hücre/mL'ye ayarlayın.
- Transwell sisteminin apikal ortamını çıkarın ve 1,5 mL bakteriyel süspansiyon ekleyin. Sistemi genel hücre kültürü koşullarında (37 °C, %95 nem, %5CO2) 2 saat boyunca birlikte kültürleyin.
NOT: Bu süre, gerekli deneysel protokole bağlı olarak 48 saate kadar uzatılabilir. Ortak kültür, rutin hücre bakımı için kullanılanlardan farklı bir kuluçka içinde tutulabilir, böylece kontaminasyonları önleyebilir. - 4.11'de tanımlandığı gibi epitel bariyerinin bütünlüğünü değerlendirmek için kuluçka sonrası TEER değerlerini ölçün.
- İnkubasyon süresi tamamlandıktan sonra apikal ortamı çıkarın ve daha fazla analiz için 0,5 mL toplayın (S4). Bir alt madde örneği, üreticinin talimatlarına uygun olarak Laktat Dehidrojenaz (LDH) testiyle hücre yaşamlılığının değerlendirilmesi için kullanılabilir ( bkz. Malzeme Tablosu).
- HBSS'ye 0,5 mL 10 mM N-asetilsistein (NAC-tampon) eklenerek HT29-MTX tarafından üretilen mukusun çözünürlüğünü ve yapışkan bakterileri geri kazanmasını sağlar. Plakaları 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin, çalkalama altında (135 rpm, bkz. Malzemeler Tablosu).
- NAC-HBSS'yi bir mikrosantrifüj tüpünde (S5) geri kazanın ve hücreleri 1 mL DPBS ile iki kez yıkayın.
- Monokatmanların üzerine %0,5 0,5 Triton X-100 (w/v) ekleyin, pipetle hücreleri bozun, sıvıyı geri kazanın ve 1 dakika girdabınızı yapın. Deterjanla bakteri hücrelerine zarar vermemek için hız çok önemlidir.
- Hücreleri 2.650 x g hassasiyetinde 5 dakika santrifüjle yapın ve süpernatantı (S6) ile pelleti (S7) ayırın.
7. Örnek Analizi
NOT: S1-S7 gibi bakteriyel canlılığı ve bağırsak hücrelerine yapışma potansiyelini değerlendirmek için analiz edin; simüle edilmiş gastrointestinal sindirim yapıldıktan sonra.
- Bakteriyel yaşamalılık: S1-S5 örneklerini 0.45 μm filtreden iki kez geçirin ve 2.8. adımda belirtildiği gibi canlı/ölü hücre boyama ve akış sitometrisi kullanarak bakteri hücrelerini nicelikle ölçün.
- Yapışma potansiyeli: S1-S6 için seri seyreltmeler (-1'den -8'e kadar) hazırlanın ve kan agarı ile modifiye edilmiş BHI plakalarında 10 μL çizgi oluşturun. 37 °C'de anaerobik koşullarda 24–48 saat kuluçka yapın. Aynı hacimde seyreltilmemiş S7 ile plaka yapın.
- Yapışkan bakterilerin taksonomik tanımlanması:
- Kültür döngüsü ile bireysel kolonileri seçin ve her birini 10 μL nükleaz içermeyen suya yeniden askıya alın. Bu süspansiyondan 4 μL toplayın ve 2.7.1'de açıklanan primerler ve koşullar kullanılarak 16S rRNA geninin PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanın.
- 2.7.3'teki protokole uygun olarak dizileme işlemi ve 2.7.4'te yer alan prosedürle dizinin doğrulanmasını gerçekleştirin.
- Toplam DNA çıkarma, qPCR niceliklendirme ve/veya 16S rRNA amplikon dizileme, RNA ekstraksiyonu ve istendikçe transkriptomik profilleme gibi daha ileri analizler yapın.
NOT: Akış sitometrisi nicelendirmesi örnekleme yaptıktan hemen sonra gerçekleştirilmiştir. Membran geçirimli hücreler için kontrol olarak, 3 dakika boyunca 70 °C'ye maruz kalan bir örnek kullanıldı. Arka plan gürültüsü, bakterisiz hücre kültürü modelinden alınan sindirim sıvıları veya örnekler akış sitometrisiyle ölçülerek değerlendirildi. Her örnek üçlü ölçülüydü.
Tablo 1: Hücre kültürünün korunması için hücre hatları ve ortam bileşiminin tanımı.
| Hücre kültürü | Taraflı/Askıya | Kültür Aracı | Genel ekler | Özel takviyeler | Süresi ikiye katlama | Kuluçka koşulları |
| Caco-2 (ECACC 86010202) | Taraftar | Dulbecco'nun 4.5 g/l glikoz içeren Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | İnaktif fetal sığır serumu (%10 v/v) Penisilin (100 U/mL)* Streptomisin (0.1 mg/mL)* Amfoterisin (0.0025 mg/mL)* | Glutamax (4 mM) Temel olmayan amino asitler (%1 v/v) Piruvat (1 mM) | 65–72 saat | %95 nem ve %10CO2 CO2 kuluçka makinesi ( bkz. Malzeme Tablosu) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | Taraftar | HEPES (1 mM) | 20–24 saat |
| * Antibiyotikler ve antifungaller, analizlere başlamadan 2 gün önce hücre kültüründen çıkarıldı. |