$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Genomik Çıkarma Kiti kullanarak Bitki Dokusundan Genomik DNA'yı İzole Edin
- Narenciye yaprağı dokusunu temiz makasla bir narenciye ağacından tamamen taze bir yaprak kesip temiz plastik sandviç torbasına yerleştirerek elde edin.
NOT: Yaprak dokusunu içeren poşet, toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede 4 °C bir buzdolabına veya buz üzerinde, izole bir kapta konmalıdır, böylece bozulma sağlanmamalıdır. - Bir havan ve havanı soğutmak için az miktarda sıvı azot ekleyin. Soğutma sırasında, yaklaşık 1 inç kare büyüklüğünde küçük bir yaprak dokusu parçasını makasla kesin. Kesilen dokuyu havana yerleştirerek anında dondurun. Gerekirse daha fazla sıvı azot ekleyin.
NOT: Sıvı azot kullanılırken her zaman yalıtımlı eldivenler giyilmelidir. - Bitki dokusunu harç kullanarak hızlıca ince bir toz haline getirin. Sıvı azot tamamen buharlaşana kadar öğütmeye devam edin ve kalan ince yeşil toz kalır.
- Bir metal spatulayı sıvı azotta 10 - 15 saniye kısa süreliğine soğutun, ardından harç içindeki topraklanmış dokuyu spatula ile 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın.
- 1000 μL pipet kullanarak 600 μL Çekirdek Liz Çözeltisi (bkz. Malzeme Tablosu) ekleyin. Numuneyi 1 - 3 saniye girdabla bekletin, ardından 65 °C su banyosunda 15 dakika kuluçka yapın.
- 10μL pipet kullanarak lizata 3 μL RNase Çözeltisi ekleyin, tüpü 2-5 kez ters çevirip karıştırın ve 37 °C'de bir dolap kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçka yapın.
NOT: Karışımın oda sıcaklığına kadar soğumasına izin verin. - 200 μL Protein Çökeltme Çözeltisi ekleyin, 20 saniye yüksek hızda girdabı yapın, ardından 13.000 x g ile 3 dakika santrifüj yapın ve sert bir pelet oluşturuldu. Örnek santrifüj yapılırken, taze 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 600 μL oda sıcaklığında izopropanol ekleyin.
- 1000 μL pipet kullanarak, santrifüjlenmiş örnekten süpernatantı dikkatlice çıkarır ve izopropanol içeren taze 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarılır. Pelet artık atılabilir.
NOT: Süpernatantı proteinle kirletmekten kaçının, pelletin üzerinde çok az miktarda süpernatant bırakın. - Tüpü ters çevirin, DNA iplik benzeri iplikler kütlesi olarak görünür hale gelene kadar, ardından oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 x g ile santrifüj yapın.
- Süpernatantı dekant edin, pellete %70 etanol 600 μL ekleyin, tüpü birkaç kez ters çevirerek DNA'yı yıkayın ve 1 dakika boyunca 13.000 x g seviyesinde santrifüj yapın.
- Etanolü dikkatlice aspire edin, gevşek DNA pelleti bırakın, ardından tüpü açıp ters çevirin, emici kağıda dinlensin. Oda sıcaklığında 15 dakika hava kurut.
- Kurutulmuş DNA peletine 100 μL DNA Rehidrasyon Çözeltisi ekleyin, ardından DNA'yı 65 °C su banyosunda 1 saat kuluçka edin, tüpü tıklayarak aralıklı olarak karıştırın.
- 1 μL arıtılmış suyu bir mikroküvete yerleştirin ve boş olarak kullanılacak bir spektrofotometreye yerleştirin. Mevcut DNA konsantrasyonunu hesaplayın; örneğin 1 μL mikroküvete yerleştirilip spektrofotometreye yerleştirilmesi. DNA konsantrasyonu (ng/μL) (A260 - A320) olarak hesaplanabilir × sulandırma faktörü × 50 ng/μL.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numune 4 °C'de saklanabilir.