<ol style="margin-top: 0in"><li> Kuyruk parçaları (3mm) ve işareti kulakları kesin. </li><li> 720 m l STE ve 30 m l Proteinaz K (10 mg / ml stok) ekleyin. </li><li> 55 inkübe ° C ısıtma bloğu ve vorteks her saat 3 saat için 10 saniye boyunca en yüksek hızda. </li><li> 70 ° C&#39;de 5 dakika proteinaz K inaktive. </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde Quench. </li><li> Tam hızda 10 dakika kuyruk DNA santrifüjleyin. </li><li> 720 m l Isopropanol içeren yeni bir tüp içine süzün . &nbsp; </li><li> Çökelme DNA tersini tüp veya vorteks. </li><li> 5 dakika tam hızda DNA aşağı spin. Süpernatantı. </li><li> Pelet% 70 etanol ile yıkayın. </li><li> Genomik DNA 5 dakika tam hızda dönerler. Süpernatantı. </li><li> DNA 1-2 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Pelet boyutuna bağlı olarak 100-200 m l DNA süspanse edin. </li><li> Yeri tüp 55 ° C &#39;de 1 saat süreyle DNA çözülme kolaylaştırmak. &nbsp; </li></ol>

<table><tbody><tr><td>STE</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / H2O içinde</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

fare tails genomik dna izolasyonu

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Burada 10 günlük bir fare yavrusu var; kuyruk biyopsisi yapacağım ve ardından kuyruğundan genomik DNA ekstraksiyonu gerçekleştireceğim. İşlem olarak, kuyruğun ucundan yaklaşık üç milimetre kadar küçük bir parça keseceğim, ardından bu kuyruk parçasını bir Eppendorf tüpüne yerleştirip tüpü kuru buz üzerine koyacağım. Bir fareden diğerine kontaminasyonu önlemek için, genellikle jilet üzerinde son kesimi yaptığım yeri işaretlerim.Böylece bir sonraki fare için, bir sonraki kuyruk biyopsisini alırken temiz bir jilet parçası kullandığımdan emin olacağım. Yumatanızdaki farklı fareleri birbirinden ayırt etmek için fareleri tanımlamanın bir yoluna ihtiyacınız olacak. Bunun bir yolu, burada gösterilen bir kulak delici kullanarak kulaklarına delik açmaktır.Fareyi, göründüğü gibi ensesinden nazikçe tutun, ters çevirin ve kuyruğunu parmaklarınızla sıkıştırın. Diğer elinizle kulak delme aletini alın ve farenin kulağında hızlıca bir kesik oluşturun. Bunun ne kadar ağrısız olduğunu gördünüz mü?Tamam, şimdi bu Eppendorf tüplerinde bazı kuyruk parçaları olduğunu görebilirsiniz ve şimdi bunların sindirilmesine yardımcı olacak solüsyonları ekleyeceğim. İlk olarak 720 µL STE solüsyonu ekleyeceğim ve ardından 30 µL Proteinase K ekleyeceğim. İşte sindirim işleminden önce kestiğimiz kuyruk parçasına yakından bir bakış.Şimdi kuyruk parçalarını 55 °C'lik bir ısıtma bloğuna yerleştireceğim. Birçok protokol 55 °C'de sürekli sallama işlemi gerektirir, ancak benim çalışmamda kuyruk parçalarını vorteksleyeceğim için buna gerek olmayacaktır. Şimdi kuyruk parçasını iki saniye boyunca vorteksleyeceğim.Bir, iki. Vortekslemeden sonra, ependorf tüpünün içindeki kalıntılara baktığımızda, kuyruk parçasının tamamen çözündüğünü görebilirsiniz; proteinaz K'yi 70 °C'de beş dakika boyunca aktive edin. Beş dakika boyunca buz üzerinde soğutarak işlemi durdurun.Kuyruk parçalarını bir mikro santrifüjde tam hızda 10 dakika boyunca çöktürün. Bu mikro santrifüjde tam hız 13,000 RPM'dir. Sindirim kuyrukları çöktürülürken, bazı einor tüplerini etiketleyin ve einor tüplerini 750 µL isopropanol ile doldurun.Sindirilen kuyruklar santrifüj edildikten sonra, kıl ve sindirilmemiş materyaller tüpün dibinde bir pelet oluşturacaktır; çözeltiyi boşaltın. Sindirilmiş materyali, STE ve proteinaz K içeren çözeltiyi, izopropanol içeren Eppendorf tüpüne aktarın; DNA çözeltiden ayrılmaya başlayacak, hayaletimsi ve tüy gibi görünecektir ve işte orada yüzen o kabarcık, farenin kuyruğundan izole edilmiş genomik DNA'dır. İzopropanol ve STE çözeltisi karıştırıldıktan sonra, genomik DNA çözeltiden ayrılacak ve tam burada küçük bir top şeklinde görünecektir; çökelmiş genomik DNA'yı bir mikrosantrifüjde beş dakika boyunca tam hızda santrifüj edin.Tüpün dibinde peletlenmiş genomik DNA'mızı görebiliriz. Şimdi, tüpteki çözeltiyi aspire ederek sadece genomik DNA peletini geride bırakacağım. Her yeni tüpü aspire ettiğimde pipet ucunu değiştireceğim.Aspiratörün ucuna bir pipet takın. STE ve izopropanolü aspire ettikten sonra, genomik DNA peletini yıkamak için 1 mL %70 etanol ekleyeceğim. Genomik DNA peleti genellikle mikro santrifüj tüpünün kenarına yapıştığından ve %70 etanol içinde tamamen yıkamak için yerinden çıkarmak zor olduğundan, burada bulunan mikro santrifüj tüpü rafına sürterek peleti yerinden oynatmanız gerekecektir.Bunu şu şekilde yapabilirsiniz. İşte çöktürüldükten ve %70 ethanol ile yıkandıktan sonraki genomik DNA'nın görünümü. Bunu tekrar tam hızda beş dakika boyunca santrifüj edeceğim ve ardından %70 ethanol'ü aspire edeceğim; yıkama işlemi tamamlanan genomik DNA peletlerini santrifüjle çöktürün.%70 etanol ile beş dakika boyunca tam hızda santrifüjleyip, ardından %70 etanolü aspire edeceğiz ve DNA'nın beş dakika boyunca kurumasını bekleyeceğiz. Tüpün dibindeki genomik DNA peletine baktığımızda, istediğimiz kuruluk seviyesine ulaştığını görebiliriz. Böylece fare kuyruklarından elde edilen genomik DNA peletlerini kuruttum ve şimdi 100 µL pH 8'de 40 mM Tris ekleyeceğim.Genomik DNA'yı, oda sıcaklığına kıyasla daha hızlı çözünmesini sağlamak için 50 °C'ye getirdim. 50 °C'de yaklaşık bir saat beklettikten sonra, transgenim için hangi farelerin pozitif olduğunu belirleyeceğim PCR reaksiyonlarını gerçekleştirmek isteyeceğim zamana kadar örnekleri ya donduracağım ya da 4 °C'de saklayacağım.

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Bu makalede

Protokol

Malzemeler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
STE	Tampon			100 mm Tris; pH 8.5 /5 mM EDTA /0.2% SDS /200 mM NaCl / H2O içinde
TE	Tampon			100 mM Tris; pH 5.0 /1 mM EDTA /10 mM NaCl