Yöntem makalesi

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

38.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/2462

⸱

3 Şubat 2011

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington School of Medicine

Bu makalede

Özet

Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.

Özet

Hipokampus, limbik sistemin bir bileşeni, uzun süreli hafıza ve mekansal navigasyon 1 önemli roller oynar. Hipokampal nöron bağlantıları güçlü aktivasyon kısa bir süre sonra gücünü değiştirebilirsiniz. Uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) olarak bilinen bu fenomen, saatler veya günler sürebilir ve öğrenme ve hafıza 2 için en iyi aday mekanizması haline gelmiştir. Buna ek olarak, 3 hipokampus iyi tanımlanmış anatomi ve bağlantı sinaptik iletim ve sinaptik plastisite 4 çalışmada klasik bir model sistem yaptı.

Hipokampal sinaps fizyolojisi anlayışımız büyüdü ve moleküler oyuncular tespit oldu, sinaptik proteinlerin işlemek için zorunlu bir ihtiyaç haline geldi. Organotipik hipokampal kültürler kolay gen manipülasyon ve hassas farmakolojik müdahale imkanı sunan ancak sinaptik organizasyon korumak, rutin kültür ayrışmış nöronlar yöntemleri daha natüralist bağlamında sinaps fonksiyonu anlamak için kritik.

Burada diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir hipokampal dilim hazırlamak ve kültür bir yöntem mevcut. Bu yöntem viral enfeksiyon 5,6 veya biolistics 7 gibi farklı yaklaşımlar kullanarak genetik manipülasyon dilimleri için kolay erişim sağlar. Buna ek olarak, dilim kolayca biyokimyasal testleri 8 için geri olabilir, ya da görüntüleme 9 veya elektrofizyolojik deneylerde 10 mikroskoplar aktarılır.

Protokol

1. Hipokampal Dilimleri Hazırlama Başlamadan Önce.

  1. Teflon levha bir parça yerleştirerek yeni bir bıçak montaj doku dilimleme makinesi hazırlayın.
  2. % 70 etanol ile silin ve doku kültürü (TC) kaput diseksiyon mikroskobu içine yerleştirilmiş. Davlumbaz, mikroskop, doku dilimleme makinesi ve UV ışığı ile 15 dakika boyunca tüm diseksiyon aletleri sterilize edin.
  3. Altı iyi TC tabak hazırlayın. Her bir kuyunun 750 mcL dilim kültür ortamı (SCM), başına iyi yer ve hücre kültürü ekler ekleyin. Membranlar altında kabarcıklar ile iyice ıslak emin olun. 35 kuvöz tabak yerleştirin ° C kadar gerekli% 5 CO 2 ile gaz verilerek.
  4. 100 ml beher içine 50 ml düşük Na + ACSF (çözüm diseksiyon) dökün ve buz-tuz karışımı yerleştirin. Kabarcık düşük Na + ACSF% 5 CO 2 /% 95 O 2 ile renk değişimleri ve ACSF, dondurulmuş ve sıvı solüsyonu (10-20 dakika) bir bulamaç karışımı oluşturana kadar .
  5. P5-P7 sıçan yavru alın. Kadar üç yavrular kullanılabilir.

2. Hipokampal Dilimleri hazırlanması.

  1. Hayvan başkanı, keskin bir yardımcı program makas ile kesin. Cildi kesin ve kafatası maruz. Sonra küçük makas ile sagital sütür boyunca interaural hat boyunca yan yana gelen kesme ve kafatası açın. Kemik ve beyin maruz kaldırarak kolaylaştırmak için ön yan yana isteğe bağlı kesim yapılabilir. Yuvarlak bir kaşık mikro spatula ile hızlı bir şekilde beyin kepçe ve yaklaşık 1 dakika süreyle soğuk çözüm diseksiyon bulamaç yerleştirin. 60 mm bir tabağa buz soğuk diseksiyon çözüm ~ 10 ml dökün ve beher çanak beyin transferi. Beyin çözüm diseksiyon ile kaplanmış olmalıdır.
  2. Altında mikroskop diseksiyon: Yer beyin ve 60 mm çanak alt basıldığında diseksiyon forseps ile orta hat tutun. Ortabeyin bırakarak hemisferlerin ayrı hipokampus kesme aleti kullanın. Hippocampi sonra her yarımkürede maruz kalmaktadır. Sonra yavaşça aracı diseksiyon hipokampus hipokampus kepçe. Hipokampus tamamen izole etmek ve mümkün olduğunca temiz diseksiyon iğnesi kullanın.
  3. Snipped P1000 filtre pipet ucu hafifçe hipokampus aspirat ve doku dilimleme makinesi teflon levha aktarmak. Konkav hipokampus yerleştirin.
  4. Koronal bölümleri almak ve aşırı sıvı drenaj hippocampi dik bıçak hizalayın.
  5. Hippocampi her 400 mikron dilimleyin.
  6. ~ 10 ml soğuk SCM, dilimleme makinesi, başka bir snipped P1000 filtre ucu ve soğuk SCM kullanarak hippocampi dilimlenmiş bir 60 mm bulaşık ve transfer içine dökün. Kabarcıklar yapmak kaçının.
  7. Iris spatula ve düz bir spatula yardımıyla hafifçe birbirinden dilim ayırın.
  8. Iyi tanımlanmış ve hasarsız hasarlı dilim dilim ayırın.

3. Hipokampal Dilimleri Kültür

  1. Inkübatör SCM ve hücre kültürü ekler ile altı kuyucuğu getirin. Başka bir snipped P1000 filtre ucu yardımı ile tek tek dilimler, membran üzerine aktarın. Membran başına 4-5 dilimleri yerleştirin. Dilimleri eklemek duvar ya yakın ya da birbirlerine yakın yerleştirmek için dikkatli olun. Gerektiğinde ayrı dilim iris spatula kullanın. Aşırı orta çıkarın. Membran bir dilim mümkün olduğunca az dokunun.
  2. Geri inkübatör plaka ve kültür 35 ° C ve% 5 CO 2 taşıyın.
  3. SCM Pasteur pipeti ile aspire TC kaput içinde SCM her 48 saat değiştirin. Taze önceden ısıtılmış SCM de ortalama 750 mcL ekleyin. Membranın altında kabarcıklar oluşur emin olun.

4. Çözümler

  1. Düşük Na + ACSF - dilim kültürlere Diseksiyon Çözüm
    Deiyonize ve steril H 2 O eklemek için:
    500 ml için 1000 ml için Final Konsantrasyon
    CaCl 2 (1 M) 0,5 mL 1 ml 1 mM
    D-glikoz 0,901 g 1,802 g 10 mM
    KCl 0,149 g 0,298 g 4 mM
    MgCl 2 (1 M) 2.5 mL 5 ml 5 mM
    NaHCO 3 1.092 g 2.184 g 26 mm
    Sakaroz 40 g 80 g 234 mm
    DPBS Fenol Kırmızı Çözüm% 0.5 0,5 mL 1 ml % 0.1 v / v

    Mix ~ 30 dk.
    Steril0.22μm filtre geçişi tarafından ize
    4 ° C artık 2 aydan az 50 ml alikotları ve mağaza olun.
  2. Dilim Kültür Orta (SCM)
    500 ml için 1000 ml için Final Konsantrasyon
    MEM Eagle orta 4.2 g 8.4 g 8.4 g / l
    At serum ısı inaktive 100 mL 200 mL % 20
    L-Glutamin (200 mM) 2.5 mL 5 ml 1 mM
    CaCl 2 (1 M) 0,5 mL 1 ml 1 mM
    MgSO 4 (1 M) 1 ml 2 mL 2 mM
    İnsülin (1 mg / ml), 0.01 N HCl içinde çözünmüş 0,5 mL 1 ml 1 mg / l
    Askorbik Asit, çözüm (% 25 w / v) 0.024 ml 0.048 ml 0,00125%
    D-glikoz 1.16g 2.32g 13 mm
    NaHCO 3 0.22g 0.44g 5.2 mM
    HEPES 3.58g 7.16g 30 mm

    Iyice eriyene kadar karıştırın ve oda sıcaklığına getirmek.
    1 N NaOH ile pH 7,27-7,28 için ayarlayın.
    Ölçü ozmolarite. Deiyonize ve sterilize H 2 O. ile 320 mmol / kg ayarlayın Yaklaşık 25-40 ml eklemek için bekliyoruz. Ozmolarite yeniden kontrol edin.
    Ozmolarite ayarlayarak, *** pH biraz değişebilir, bu tamam, ozmolarite doğru aralığı (317-323) olduğunu daha önemlidir.
    0.22 mikron filtre geçişi ile sterilize edin.
    20 ml alikotları ve mağaza olun az iki-üç hafta kadar 4 ° C
    Gluatamine stok: -20 ° C'de 2.5 mL hacimde 200 mM ve mağaza bir konsantrasyon hazırlamak.
    Askorbik asit stoğu:% 25 (w / v) 'lik bir konsantrasyon hazırlamak ve 100 mcL hacimde -20 ° C'de saklanır.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Dilimler diseksiyon kapsamında beyaz, siyah noktalar olmadan bakmak ve iyi tanımlanmış ve hasarsız CA1, CA3 ve dentat girus bölgelerinin. Bakteriyel kontaminasyon kolayca SCM orta veya bulanıklık hareket eden siyah lekeler olarak görülür. Mikroskop altında konulduğunda, dilim yüzey açık ve ayırt edilir hücre organları ile 4 gün sonra kültür temiz görünmelidir. Net hücre gövdeleri görülür ve çok enkaz 4 gün sonra yüzeyini kaplayan, daha sonra sağlıklı bir dilim değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yöntem 11 ilk Stoppini ve ark tarafından tanımlanan yöntem ve kültür hipokampal dilimleri hızlı bir şekilde sunuyor. Bu protokolün en önemli yönü dilim steril korumak için, bu nedenle uygun steril teknikler kullanmak ve düzgün doku ile temas eden tüm malzeme dezenfekte ve sterilize etmek için kritik öneme sahiptir.

Farklı serumlar kaynakları dilimleri kalitesini etkileyebilir. Biz ilk birkaç toplu test tavsiye ederiz. Kontaminasyon tekrarlayan bir sorun ise, inkübatör ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma NINDS tarafından finanse edildi - NIH R01NS060756

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre kültürü insertleriEMD MilliporePICM03050
6 kuyucuklu plakalarBD Biosciences353046
Doku DilimleyiciStoelting Co.51425/51415
MikroskopOlympus CorporationSZX7-ILLD2-100
Hippocampus diseksiyon aletiF.S.T.10099-15
Büyük kullanım makasları. PerfectionF.S.T.37500-00/37000-00 Sağ/ Sol el
İris SpatulasıF.S.T.10093-13
Düz spatulaF.S.T.10094-13
Yuvarlak kaşıklı mikro spatulaVWR international57949-039
Diseksiyon için tek keskin kenarlı iğneElectron Microscopy Sciences72946
Diseksiyon cımbızıDumont#2
Küçük diseksiyon makaslarıF.S.T.14060-10
MEM Eagle besiyeriCellgro50-019 PB
Isıl olarak inaktive edilmiş at serumuInvitrogen26050-88
L-Glutamin (200 mM)Invitrogen25030081
CaCl2 (1 M)Sigma-AldrichC3881
MgSO4 (1 M)Sigma-AldrichM2773
İnsülin (1 mg/ml), 0.01 N HCl içinde çözülmüşSigma-AldrichI0516
Askorbik Asit, çözelti (%25)Sigma-AldrichA4544
D-GlikozSigma-AldrichG5767
NaHCO3Sigma-AldrichS6014
HepesSigma-AldrichH7523
SükrozSigma-AldrichS5016
DPBS içinde %0,5 Fenol Kırmızısı ÇözeltisiSigma-AldrichP0290
KClSigma-AldrichP3911
MgCl2 (1 M)Sigma-AldrichM9272

Kaynaklar

  1. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
  2. Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
  3. Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
  4. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  5. Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  6. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
  7. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  8. Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
  9. Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
  10. Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  12. Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hipokampal Kesit Haz rlDoku Dilimleme Tekni iSteril Diseksiyon Sol syonuH cre K lt r nsertleriKesit K lt r BesiyeriHipokampal Diseksiyon AletiKesit Ay rma Y ntemink bat r K lt r Ko ullarSa l kl Kesit G rselle tirmesi

İlgili makaleler