Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Bakış: protokol dört bölümden ayrılmıştır. Bölüm 1 beslenme bakteri nasıl hazırlanacağını açıklar. Bölüm 2, solucan kültürü nasıl hazırlanacağını açıklar. Bölüm 3 ömrü puanı nasıl açıklamaktadır. Bölüm 4, bazı temsilcisi sonuçları gösterir ve Bölüm 5, gerekli çözümler hazırlamak anlatılmaktadır. Ömrü deneyleri tamamlamak için birkaç hafta sürebilir. Protokol haftanın her adım için, gün ve günün zamanı planlama kolaylaştırmak için yer almaktadır. (Gün 0) L4 aşamasında tüm protokol için referans noktası olarak kullanılır.

1. Besleme Bakteriler hazırlanması

Bu bölümde, beslenme bakterilerin hazırlık açıklamaktadır. Özel E. coli OP50 denir C.elegans beslemek için kullanılan suşu. Diğer bakterilerin solucan kültürüne çapraz bulaşmasını önlemek için bu protokol, önce, OP50 gerginlik Carbenicillin / ampisilin dirençli ²¹ yapılmıştır. OP50 4-5 gün önceden hazırlayın. OP50 ile temas eden tüm malzemeler steril olmalıdır.

-7 Gün: Perşembe (1. hafta): 5 ml, 37 gece boyunca bir tek OP50 kolonisi ve inkübe ° C bakteriyel bir çalkalayıcı 100 mg / ml ampisilin ve 0,1 mg / ml Amfoterisin B içeren TB İnokülasyon .

Gün -6: Cuma (hafta 1).

Sabah 08:30. Kültür için yeterli süre doygunluk ulaşmak için izin vermek için erken İnokülasyon

1. 50 mcg / ml ampisilin içeren 300 mL TB OP50 1:2000 gecelik kültür sulandırınız. Doygunluk ulaştı kadar 37 8-12 saat bir bakteri çalkalayıcı ° C kültür inkübe edin. Kültür 14 saatten daha uzun büyümek için izin vermeyin.
2. OP50, ön ağırlıklı steril bir santrifüj tüpü içine aktarın. Pelet bir masa üstü santrifüj 3500 rpm (2200 xg) 10 dakika süreyle santrifüj OP50.
3. Süpernatantı atın ve steril su içinde yeniden askıya OP50 pelet ve santrifüj yoluyla yeniden pelet. Bu yıkama iki kez tekrarlayın.
4. İkinci yıkamadan sonra, kalan suyun dikkatli bir şekilde kaldırın. Tüp su bırakılmalıdır. Pelet içeren santrifüj tüpü tartılır ve pelet ağırlığı belirlemek için, boş santrifüj tüp ağırlığı çıkarma.
5. 100 mg / ml 'lik bir konsantrasyon iyice S-komple pelet yeniden askıya. Hiçbir kümeleri bırakılmalıdır.
6. 100 mg / ml OP50 2 x10 ¹⁰ bakteri / ml konsantrasyonu uygun olmalıdır. ML başına bakteri optik yoğunluk ve sayı arasındaki ilişki biliniyorsa mL başına bakteri sayısını belirlemek için bir fotoğraf spektrometre kullanın. Gerekirse, OP50 besleme çözüm 2 x10 ¹⁰ bakteri / ml konsantrasyon ayarlayın.
7. 4 OP50solution Mağaza ° C kadar solucan kültürü için kullanılır.

2. Senkron Worm Kültür hazırlanması

Bu bölümde, solucan kültürünün hazırlanması açıklamaktadır. Onun hedefi, solucanlar bir yaş eşzamanlı nüfus üretmek için. , Çamaşır suyu tedavisinden sonra 5. adımda C.elegans ile temas eden tüm malzemeler steril olmalıdır . Plakalar 20 ° C sürece aksi belirtilmedikçe tutulur.

Gün -6: Cuma (hafta 1), 16:00: yeni bir plaka Transfer hayvanlar

1. Solucan nüfusunun çoğunluğu açlıktan L1 larvaları oluşan bir 5-10 gün eski NGM plaka atın.
2. Bunsen beki üzerinden kısa bir süre ısıtılması ile metal bir spatula sterilize edin. Soğumasını bekleyin. Hasret solucanları içeren plaka agar parçaları kesip soğutmalı spatula kullanın. OP50 ile taze bir 10 cm NGM plaka numaralı seribaşı üzerine bu parçaları birkaç aktarın. Yaklaşık inkübe edin. 65 saat 20 ° C kadar solucan nüfusunun çoğunluğu gravid yetişkin oluşur. Gravid yetişkin içine büyümeye hasret L1 hayvanlar için gereken zaman zorlanma zorlanma değişebilir.

Gün -3: Pazartesi (2. hafta) saat 10:00: senkron bir nüfusun oluşturulması

3. 5-10 ml steril su ile plaka yıkayarak 10 cm plaka solucanları toplayın. Solucan / su solüsyonu 15 ml konik bir tüp içine aktarın.
4. 1200 rpm (280 xg) bir masaüstü santrifüj 2 dakika santrifüj solucanlar yıkayın. Süpernatant atın ve 10 ml su ekleyin. Tekrarlayın.
5. Süpernatantı ve taze hazırlanan çamaşır suyu / NaOH çözeltisi (2.5 ml çamaşır suyu, 1 ml 10N NaOH, 6.5 ml H ₂ O) 5 ml ekleyin. Solucanların açık ara kadar oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Her dakika hafifçe vorteks için emin olun. Diseksiyon mikroskobu altında reaksiyon ilerleme izleyin.
6. En kısa sürede çözülür tüm yetişkinler gibi tepki nötralize etmek için M9 tampon 5 ml ekleyin.
7. (2500 rpm'de 2 dakika santrifüj yumurta 10 ml M9 tamponu ile üç kere yıkayın1100 xg).
8. Aynı yumurta yıkayın 10 ml G-tam 2500 rpm (1100 xg) 2 dk santrifüj.
9. Süpernatantı, 10 ml S-tam ve taze bir 50 ml konik tüp çözüm transfer. S-tam 30 ml, 40 ml nihai hacmi ekleyin. Nutator veya benzeri bir cihaz, oda sıcaklığında yavaşça gecede tüp sallamak.

-2 Gün: Salı (2. hafta), 12:00: Tohum tabak içine hayvanlar

10. Diseksiyon kapsamında, solucanlar, gece boyunca yumurtadan olmadığını kontrol edin. Diseksiyon kapsamı kullanarak 10 mcL damla solucanlar sayısı sayarak S-komple bir çözüm solucanlar konsantrasyonu belirleyin. Her bir numune için en az 10 damla güvenin.
11. 80-100 solucanlar / mL S-tam bir konsantrasyon solucanlar yeniden askıya aldı. Carbenicillin (stok 100 mg / ml) 0.1 mg / ml bir final konsantrasyon son konsantrasyonu 50 mcg / mL ve Amfoterisin B (stok 250 mcg / mL) ekleyin. Bir nutator çalkalayınız. Solucanlar büyük miktarlarda hazırlanması, filtre kapağı ile 600 mL nunclon şişesi kullanın.
12. 02:30 nihai konsantrasyonu 6 mg / ml (= 1.2 x10 ⁹ bakteri / ml) Bölüm 1 hazırlanan OP50 ekleyin. Geri dön OP50 4 ° C
13. 96 plaka her kuyuya 120 mcL worm/OP50 çözüm aktarın. Şeffaf bir alt 96 kuyucuğu kullanın. Pipetleme süre askıya solucanlar tutmak için emin olun.
14. Kontaminasyon ve buharlaşmasını önlemek için bir bant macunu kullanarak plaka Seal. 2 dakika süreyle mikrotiter plate çırpıcısı plaka Shake ve hayvanlar L4 sahne ulaşana kadar 2 gün 20 ° C'de inkübe edin.

Gün 0: Perşembe (2. hafta) öğleden önce: Fluorodeoxyuridine ekleyerek hayvanlar sterilize (FUDR)

15. Hayvanların her kuyuya 0.6 mM FUDR stok solüsyonu 30 mcL sterilize etmek. Bu adım, her bir kuyunun 150 mcL son hacmi getiriyor ve 5 mg / ml ^(1x10 9 bakteri / ml) 6 mg / ml OP50 nihai konsantrasyonu azaltır . Mühür ve plaka bant Avcılar kullanarak bir mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika sallayın. OP50 -2 gün 2:30 'da eklendi, FUDR, öğleden önce eklendi olması önemlidir. 20 ° C inkübatör plakaları dön

1. Gün: Cuma (hafta 2): kültürüne ilaç

16. By 9:00 am hayvanların en gravid ve birkaç yumurta her içermelidir. Olan etkisi ömrü istenilen konsantrasyonda test edilmesi ilaçlar ekleyin. DMSO uyuşturucu çözme Eğer DMSO son konsantrasyonları,% 0.6 C.elegans ömrünü kısaltır DMSO konsantrasyonlarda daha yüksek olarak,% 0.6 'dan fazla olmamalıdır. Ilacın eklenmesinden sonra, bant macun plakaları ve mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika sallayın. 20 ° C inkübatör plakaları dön
17. Ilaçların eklenmesi, özellikle su dışında diğer bir çözücü kullanarak, zaman zaman, plaka başına birkaç hayvanları öldürebilir. Inverted mikroskop, ölü hayvanları kontrol etmek için kullanın. Genel olarak, 96 plaka başına en az 10 ölü hayvanlar olması gerekir. 20 ° C inkübatör plakaları geri dön.

4. Gün: Pazartesi (hafta 3): Değişim Avcılar

18. Taze oksijen mühürleyen kaldırmak kültür girmek için izin vermek için, 1 dakika bekleyin ve plaka yeniden mühürlemek. Mikrotiter plate çırpıcısı 2-3 dakika plaka çalkalayınız. Haftada bir kez tekrarlayın.

5. Gün: Salı (3 hafta): açlık önlemek için yeni OP50 ekle

19. 96 kuyu açlık önlemek için her bölüm 1 hazırlanan 100 mg / ml OP50 çözüm 5 mcL ekleyin.

3. Ömrü, Puanlama.

Bu bölümde, Bölüm 2 senkronize solucan nüfusun yaşam hayvanlar ölene kadar nasıl izlenir açıklamaktadır. 96 kuyucuğu hayvanları gözlemlemek için, 2x veya 2.5x objektif bir inverted mikroskop kullanın. Kayıt sağkalım verileri haftada üç kez, Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri. Hareket hayvanların canlı ya da ölü olup olmadığını belirlemek için kullanın. Güçlü ışık, özellikle de mavi ışık taşımak için hayvanların neden olur. Testte ölü hayvanlar çıkarmayın. Bazen, hayvanların hareket etmedi ve bir önceki sayısında ölü tespit edildi, daha sonra üzerinde hareket edebilir.

1. 0 gün, deney başında solucanlar her kuyuda toplam sayısını. Bu kuyulardan hayvan olarak analiz fazla 18 hayvan içeren kuyu sansür yeterli OP50 olmaz ve diyet kısıtlaması etkilerini gösterecektir.
2. Hayvanların hareket ettiğini, 2 dakika süreyle mikrotiter plate çalkalayıcı 96 plaka sallamak şansını artırmak için. önce sayma.
3. Her sayma oturumda, kayıt tarih ve hayvanların sayısı.canlı hayvan olarak hareket ettirin. Sıvı hareket katı ortam üzerinde çok daha kolay ve güçlü ışıkları ile uyarılabilir. Daha yüksek bir büyütme yutak ucu gibi çok ince hareketler nokta yardımcı olabilir. Bu ince hareketler, sık sık çok yaşlı hayvanlarda görülen tek hareket.
4. 20 ° C inkübatör plakaları dön
5. Tüm hayvanların ölü kadar 2-3 günde bir 2-4 adım tekrarlayın.

4. Temsilcisi Sonuçlar.

Bu bölüm, bu testte ve bazı temsilcisi sonuçları tarafından oluşturulan ömrünü veri kayıtlarını tutmak nasıl bir örnek gösterir.

Şekil 1A Bu testte sırasında ömrü veri kaydetmek için nasıl bir örnek gösterir. Bir excel sayfasına her kuyuda nüfusun hayatta kalma izlemek için kullanılır. Her iyi plakasını koordine, gerilme, ilaç, ilaç konsantrasyonu ve 0 gün canlı hayvanların toplam sayısı (X0) Deneyin başında. Kayıt tarihi yanı sıra, her bir kuyu içinde çeşitli toplumlarda hayatta takip edebilmek için bir hafta, canlı ve ölü hayvan sayısının üç katı. Sonuçları grafik için, her gün için canlı hayvanların kısmını hesaplamak ve gün içinde zamanın bir fonksiyonu olarak arsa. P-değerleri STATA ya da benzer bir yazılım gibi istatistiksel paketleri kullanılarak hesaplanmalıdır.

C.elegans, orta ömrü sıcaklığa bağlıdır. Şekil 1B ömrü sıcaklık bağımlı değişiklikler doğru ömrü testi ²² mikrotiter çoğaltılamaz olduğunu gösterir. Benzer şekilde, mikrotiter plate assay vahşi tip N2 hayvanlar ^{23-24 25} (Şekil 1C) farklı yaşam süresini bildirildi mutantlar ömrü değişiklikler üretir.

Tahlil daha nicel ifadeler yapmak için kullanılabilir. Fig1D ortalama ömrü ⁷ Mirtazepine konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Her veri noktası 7-12 nüfusun ortalama ömrü, her zamanda farklı yaşam temsil eder. De başına hayvan sayısı (5-15 hayvanlar) nispeten düşük olsa da hata çubukları görüleceği gibi, iyi-iyi varyasyon nispeten küçük.

Şekil 1 tabanlı ömrü testi mikrotiter plate literatürde bildirilen ömrü değişiklikleri doğru üretir.
(A) Örnek verileri bir Excel hesap toplanmıştır. Her sayma oturum tarih boyunca, iyi koordine etmek ve canlı ve ölü hayvan sayısı kaydedildi. Deneyin başında, her bir kuyunun hayvanların toplam sayısı tespit edildi. (B) vahşi tip sağkalım eğrisi (N2) hayvanlar 20 büyüdü ° C ve 25 ° C (C) ömrü etkileyecek mutasyonları taşıyan suşlarının sağkalım eğrileri. Her dört suşları 20 ° C'de paralel olarak ölçüldü (D) Mirtazepine tedavi N2 hayvanlar doz yanıt eğrisi. Ortalama ömrü Mirtazepine konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Hata çubukları başına 8 kuyu durum SEM göstermektedir.

5. Malzemeler.

M9 tampon, 1000 mL

• 6 g Na ₂ HPO ₄
• 3 g KH ₂ PO ₄
• 5 g NaCl
• 0,25 g MgSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• 1000 mL deiyonize su ekleyin
• Otoklav

Potassiumphosphate tampon pH 6.0, 1000 mL

• 136 g KH ₂ PO ₄
• 900 mL deiyonize su ekleyin
• 5M KOH ile pH 6,0 'a ayarlayın.
• 1000 mL deiyonize su ekleyin
• Otoklav

Trace metal çözümü

• 1,86 g Na ₂ EDTA
• 0.69 g FeSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• 0,20 g MnCl ₂ ∙ 4H ₂ O
• 0.29 g ZnSO ₄ ∙ 7H ₂ O
• 0.016 g CuSO ₄
• 1000 ml su deiyonize
• Otoklav ve karanlıkta saklayın.

S-bazal orta, 1000 mL

• 5.9 g NaCl
• 50 ml 1M potasyum fosfat, pH 6.0
• 1000 ml su deiyonize
• Otoklav
• Sonra, 5 mg / ml 'kolesterol (Et-OH çözünmüş) 1 ml eklemek çözüm soğumasını bekleyin.

Potasyum sitrat 1M, 1000 mL

• 268,8 g tripotasyum sitrat
• 26.3 sitrik asit monohidrat
• 900 mL deiyonize su ekleyin
• 5M KOH ile pH 6,0 'a ayarlayın.
• 1000 mL deiyonize su ekleyin
• Otoklav

S-tam orta, 1000 mL

• 977 ml S-bazal
• 10 ml 1M potasyum sitrat pH 6 (steril)
• 10 ml Trace metaller çözüm (steril)
• 3 ml 1M CaCl ₂ (steril)
• 3 mL 1M MgSO ₄ (steril)

NGM agar

• 3.0g NaCl
• 2.5g pepton(Kazein gelen, pankreas sindirimi)
• 17g Agar
• 975 mL deiyonize su ve karıştırma çubuğu ekle
• Otoklav
• - - 55 soğumasını otoklav sonrası ° C ve aşağıdaki bileşenleri ekleyin:
  • 0.5 mL 1M CaCl ₂ (steril)
  • 1 mL etanol içinde 5 mg / ml Kolesterol
  • 1 ml 1M MgSO ₄ (steril)
  • 25 ml Potassiumphosphate tamponu, pH 6.0 (steril)

TB, 1000 mL

• 12g Bacto Tripton
• 24 gr Maya Özü
• 4 mL gliserol
• 900 mL deiyonize su ekleyin
• Otoklav
• - - 55 soğumasını otoklav sonrası ° C ve aşağıdaki bileşen eklemek:
  • 100 mL 0.17M KH ₂ PO ₄ / 0.72MK ₂ HPO ₄

0.6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma kedi # F0503), 1000 mL

• 100 mg FUDR
• Çözülür S-tam steril 670 ml, 10 ml veya 45 ml alikotları olun.
• -20 ° C'de muhafaza

100 mg / ml Carbenicillin, 10 ml

• 1 g Carbenicillin
• 10 ml steril deiyonize su
• Steril süzüntü ve kısım
• -20 ° C'de muhafaza
• Son bir 50 mg / ml konsantrasyonda

250ug / ml Amfoterisin B, 4 mL

• 1mg Amfoterisin B
• 4 mL Et-OH
• -20 ° C'de muhafaza
• Son bir 0.1 mg / ml konsantrasyonda