Yöntem makalesi

Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler

DOI:

10.3791/2560

⸱

19 Nisan 2011

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute- WPI

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dönüştürmek için basit ve etkili bir yöntem Physcomitrella pantens Protoplast açıklanmıştır. Bu yöntem için protokolleri uyarlanmıştır Physocmitrella Protonemal protoplast ve Arabidopsis Mezofil protoplast dönüşüm 1.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Physcomitrella pantens protoplast dönüştürmek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem Physocmitrella protonemal protoplast ve Arabidopsis mezofil protoplast dönüşüm 1 protokolleri uyarlanmıştır. Verimli mitotik homolog rekombinasyon geçmesi kapasitesi nedeniyle Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler, son yıllarda 2 önemli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır . Bu kapasite, Arabidopsis gibi diğer model tesislerinde görülen 3-9 hedef gen yüksek frekansları sağlar . Bu sistemin tam olarak yararlanmak için, biz yosun hücrelerin içine DNA sunmak için etkin ve kolay bir yöntem gerekir. Bu yosun dönüştürmek için en yaygın yolu, partikül bombardımanı 10 ve PEG-aracılı DNA alımı 11 . Partikül bombardımanı yüksek dönüşüm verimliliği 12 üretebilir rağmen, gen silahlar birçok laboratuvarda hazır değildir ve protokol standardize etmek zordur. Öte yandan, PEG aracılı dönüşüm uzman ekipman gerektirmeyen, ve steril bir kukuleta ile, herhangi bir laboratuvar yapılabilir. Burada, yosun protoplast dönüşüm için basit ve son derece etkili bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem daha önce 13 DNA, en verimli protokolü bir gelişmedir mikrogram başına 120'den fazla geçici transformants üretebilir . Basitlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlik için, bu yöntem rutin dönüşümün yanı sıra çok sayıda transformants gerektiren projeler için uygulanabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protoplast yapma

  1. Petri kabı mannitol% 8 9 ml ekleyin.
  2. 5 2-3 PPNH4 plakalardan bir spatula kullanarak, 7 gün eski yosun koymak Petri kabı içeren mannitol.
  3. Petri kabı 3 ml (Sigma D9515-25G) 2% Driselase ekleyin.
  4. Petri kabı, 1 saat süreyle hafif sallayarak ile oda sıcaklığında inkübe edin.
  5. 100 mikron mesh (BD Falcon 352.350) ile protoplast süspansiyon Filtresi.
  6. 5 dakika boyunca 250 gr süzülmüş süspansiyon dönerler. Süpernatantı.
  7. 500 mcL% 8 mannitol ile çok yavaşça protoplast yeniden askıya.
  8. Kültür tüpüne 9.5 ml% 8 mannitol ekleyin. Protoplast tamamen askıya alınır emin olun.
  9. Filtrasyon ve yeniden süspansiyon adımları (1.6, 1.7 ve 1.8) iki kez daha tekrarlayın.
  10. Protoplast çözüm 10 mcL alın ve bir hemasitometre protoplast saymak.
  11. (Bkz: Şekil 1) mL başına protoplast numarası almak için 16 kare alanda protoplast sayısı 10.000 ile çarpın.

2. Dönüşüm

  1. 5 dakika için 250 g protoplast süspansiyon Spin. Süpernatantı.
  2. 1,6 milyon protoplast / mL konsantrasyonda MMG çözüm protoplast yeniden askıya.
  3. Protoplast süspansiyon 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. Protoplast süspansiyon 60 mg DNA içeren bir kültür tüpe 600 mcL ekleyin. Tüp nazikçe Swirl.
  5. 700 PEG / Ca çözüm mcL protoplast / DNA karışımı ekleyin. Swirl tüp nazikçe tüm karışımı homojen kadar.
  6. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  7. Bu bekleme süresi sırasında, PRM-B selofan levhalar (80 mm çapında daireler, AA Ambalaj Limited Şirketi, Birleşik Krallık) kapak; levha yüzeyi üzerinde en az 5 dakika hidrat izin selofan.
  8. Spatula ile, selofan ve plaka arasında sıkışmış hava kabarcıkları.
  9. W5 çözüm 3 mL karışım sulandırınız.
  10. Spin karışımı 5 dakika boyunca 250 gr. Süpernatantı.
  11. PRM-T eritilmiş 2 mL yeniden askıya protoplast (bu çözüm, 42 ° C'de sıvı muhafaza edilebilir protoplast eklemeden önce). Plaka PRM-B selofan kapsadığı plaka başına yeniden askıya protoplast 1 ml. Micropore (3M Sağlık) plakaları sarın. Bir büyüme odasında plakalar 25 ° C'de tutun.
  12. Alternatif olarak, 1 ml sıvı kaplama orta ve selofan ile kaplanmış bir PRM-B plaka kaplama 0,5 mL protoplast yeniden askıya alınmış olabilir. Bu hızlı yenilenmesini sağlar, ancak yenileyici bitkilerin sayısı düşüktür.
  13. Büyüme odası, 16 saat için ayarlanır. ışık ve 8 saat. karanlık döngüsü.
  14. Selofan dönüşüm 4 gün sonra yeni bir seçim plaka üzerine taşıyın.

3. Temsilcisi Sonuçlar:

Dönüşüm bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu örnekte kullanılan DNA hygromycin dayanıklı kaset taşıyan plazmid supercoiled 7.8 kb oldu. Fotoğrafçılığı için% 50, kaplama protoplast miktarı azaldı. Resimler bitkilerin seçimi plakaları taşındı iki hafta sonra alındı. Dönüşüm verimliliği DNA konsantrasyonu 60 mg kadar etkilenmez. DNA yüksek konsantrasyonlarda dönüşüm verimliliği zararlıdır. Bu yöntem veri DNA miktarda geniş bir yelpazede içinde tutarlı sonuç sağladığını gösterdi. Bu yöntem aynı zamanda etkili bir şekilde Tablo 1'de gösterilmiştir istikrarlı transformants oluşturabilir, daha önce 14 bildirilmiştir çok daha yüksek Lineerleştirilmiş DNA mikrogram başına 4 istikrarlı transformants alabilirsiniz.

Biz de bir belirteç olarak flüoresan protein geni taşıyan bir supercoiled plazmid dönüştürerek dönüşüm verimliliği ısı şok etkisi test edilmiştir. Isı şoku, 3 dakika boyunca 45 ° C su banyosu karışımı kuluçka (Adım 2.6 içinde), oda sıcaklığında kuluçka 10 dakika sonra gerçekleştirildi. Karışım 17 dakika süreyle ısı şok hemen sonra oda sıcaklığında su banyosunda inkübe edildi. Sonuçlar 22 saat sonra dönüşüm kaydedildi. Transformants ile elde edilen ve ısı şok olmadan oranları (~% 25) çok benzer, ama biz protoplast (veriler gösterilmemiştir) canlılığı üzerindeki ısı şok bir yan etki gözlenmedi.

figure-protocol-1
Şekil 1. Hemasitometre içinde protoplast gör. Protoplast sayımı için gerekli bölüm, kırmızı bir kare ile gösterilir . Not protoplast (1.11) sayımı için gerekli olan 16 kareler; görüntü 24 protoplast sayısı (240.000 hücre / ml).

figure-protocol-2
Şekil 2. 18 günlük geçici transformants Resimleri protoplast transsupercoiled plazmid belirtilen miktarda kurdu. A: 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg.

DNA (mikrogram) Miktarı Verim (tranformants / mg DNA)
15, plazmid supercoiled 120 ± 24
30, plazmid supercoiled 145 ± 54
60, plazmid supercoiled 121 ± 60
120, plazmid supercoiled 71 ± 38
60, plazmid lineerleştirilmiş 4 ± 1

Tablo 1: Çeşitli DNA miktarlarda Dönüşüm verimliliği.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntem Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler protoplast içine basit ve tutarlı bir DNA dönüşümü sağlar . Bu yöntem başlangıçta Arabidopsis 1 için geliştirilmiş, ancak burada Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler, daha basit ve farklı bitki protoplast ile iyi bir performans ortaya koydu. Bu nedenle, bu yöntem, küçük değişiklikler ile diğer bitki türlerinin uygulanabilir. Optimizasyonu için olası değişiklikler MMG protoplast konsantrasyon, kuluçka süresi, MMG ve PEG / Ca çözüm içerir. (Tablo 1) Bu noktada transformants sayısı kadar DNA konsantrasyonu ile doğrusal olarak artar, çünkü bizim rutin deneyler 60 mg DNA kullanmayı tercih. Biz bitkilerin büyük bir nüfus daha fazla tarama ve analiz için izin veren tek bir 60 mg DNA dönüşümü, yaklaşık 7000 geçici transformants veya 200 istikrarlı transformants alabilir.

Dönüştürülmüş protoplast sıvı kaplama, orta ya da PRM-T ile iki yayılmış olabilir. Protoplast supercoiled plazmid dönüştürülmüş olduğu rejenerasyon sıvı kaplama orta kullanıldığında verimliliği düşük olmasına rağmen, bu yöntemi tercih etmektedir. Tablo 1'de gösterdi supercoiled plazmid DNA ile yapılan dönüşümler, çok daha fazla transformants ve bu nedenle, biz hala sıvı kaplama orta ile çok sayıda bitki elde edebilirsiniz. Ayrıca, sıvı kaplama orta protoplast yayılmasını deneyler 9,15 yıkmak, RNAi olarak geçici fenotipleri içeren deneyler için önemli olan hızlı yenilenme sağlar. Buna ek olarak üst agar yokluğunda, immün ve RT-PCR 9,15 kolay bitki izolasyon sağlar .

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV NSF (IOS 1.002.837) tarafından desteklenen

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifin Adı Bileşen
PPNH 4 1.84 mM KH 2 PO 4
3.4 mM Ca (NO 3) 2
1 mM MgSO 4
2.72 mM Diamonyum tartarat
54 mcM FeSO 4 .7 H 2 O
9.93 mcM H 3 BO 3
1.97 mcM MnCl 2 .4 H 2 O
0.23 mcM CoCl 2 .6 H 2 O
0.19 mcM ZnSO 4. 7H 2 O
0.22 mcM CuSO 4. 5H 2 O
McM 0.10 Na 2 Moo 4 .2 H 2 O
0.168 mcM KI
Katı besiyeri için% 0.7 agar ekleyin.
PRM-B PPNH 4,% 6 mannitol ve% 0.8 agar . Plakalar dökülmeden önce 10 mL 1M CaCl 2 1 L ekleyin.
PRM-T PPNH 4,% 6 mannitol ve% 0.6 agar . 0.5 mL 1M CaCl kullanmadan önce 2 ila 50 ml ekleyin.
Sıvı Kaplama Orta PPNH 4% 8.5 agar olmadan mannitol. 0.5 mL 1M CaCl kullanmadan önce 2 ila 50 ml ekleyin.
2% Driselase Driselase 4 g (Sigma D9515-25G),% 8 mannitol 200 ml ekleyin. 30 dakika hafifçe karıştırın. oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 4 ° C ve 5 dakika boyunca yavaşça karıştırın. oda sıcaklığında. Pelet atın, 10 dakika Spin 2.500 gr. Filtre 10 ml alikot olarak dondurulmuş 0.22 mikron ve mağaza. Kullanmadan önce oda sıcaklığında su banyosunda çözülme.
MMG 0,4 M mannitol
15 mM MgCl 2
4 mM MES (pH 5.7)
PEG / Ca 4 g PEG4000
3 mL H 2 O
2.5 ml 0.8 M mannitol
1 ml 1M CaCl 2
W5 154 mM NaCl
125 mM CaCl 2
5 mM KCl
MES (pH 5.7) 2 mM

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
  2. Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
  3. Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
  4. Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
  5. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
  6. Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
  7. Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
  8. Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).
  9. Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
  10. Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
  11. Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
  12. Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
  13. Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
  14. Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protoplast zolasyonuYosun TransformasyonuFloresan MikroskopiDNA Al mSelofan KaplamaMannitol Y kamasDrizly SindirimiGe ici TransformantlarGen Hedefleme

İlgili makaleler