İnsan Nöral Kök Hücreler Pasajlanması

Summary

, In vitro olarak insan nöral kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) manipüle etme yeteneği, tedavi amaçlı hücre nakli olarak kendi programını araştırmak için insan sinir gelişimi ve keşfetmek için sağlar. Bu protokol, insan kök hücre araştırmalarının giderek tekrarlanabilirlik umuduyla kültür ve Pasajlanması hNSPCs bir yöntem sunmaktadır.

Abstract

In vitro insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) manipüle etme yeteneği, tedavi amaçlı hücre nakli olarak kendi programını araştırmak için yanı sıra birçok temel insan sinir gelişimi ve patoloji süreçleri keşfetmek için bir araç sağlar. Bu protokol, bu tekniğin standartlaştırılması ve insan kök hücre araştırmalarının tekrarlanabilirlik artan umutlar, kültür ve Pasajlanması hNSPCs basit bir yöntem sunuyor. Kullandığımız hNSPCs Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynağı kadavra postnatal beyin korteks izole ve şişeler yapışık kültürler fibronektin (Palmer ve ark, 2001; Schwartz ve ark, 2003) ile kaplı olarak yetiştirilir. Biz bir DMEM kültür bizim hNSPCs: F12 serum ücretsiz medya EGF, FGF ve PDGF ile desteklenmiş ve geçit onları 01:02 yaklaşık her yedi gün. Kültür hücrelerin çoğunluğunu kullanarak, bu koşulları, iki kutuplu bir morfoloji korumak ve farklılaşmamış nöral kök hücreler (örneğin nestin ve sox2) belirteçleri ifade.

Protocol

Not: Haftada bir kez, bizim hNSPCs rutin kültür için, biz her gün ve medya genellikle geçit 01:02 50-100% değişim . F12 baz medya: kültür ortamı% 20 BIT 9500 DMEM, 1X antibiyotik / antimikotik ve büyüme faktörleri (EGF, FGF ve PDGF her 40 ng / ml) içerir.

Kaplamalı Flask hazırlanması ve Hücreler Dissociating

1. 37, 10 mikrogram / ml insan fibronektin gecede 4 saat, ya da için EMEM geçişli hücreler, mont T25 şişeler ° C doku kültürü inkübatör için yeni şişeler hazırlamak. Hücrelerin sağ Pasajlanması önce, fibronektin çözüm kaldırmak ve şişeler PBS ile yıkayın.
2. Yeni fibronektin kaplı şişeler (her bir şişesi için me....

Discussion

Biz bu protokolü hNSPCs güvenilir kültürleri sağlar bulduk. Bir kritik bir faktör hücreler için oldukça yoğun kültür olarak tutulacak ve hücrelerin seyrek olduğu noktaya geçişli olamaz ihtiyaç vardır. Bizim ellerde, seyrek kültürleri çok yavaş büyür ya da tamamen bölen ateşkes. Bu nedenle, bir kültürün son derece yoğun olduğu için, genellikle kültürler 1:2 veya 01:03 bölünmüş. Iyi hücre eki ve göç teşvik eden, ancak, laminin aksine, aynı zamanda hücreleri ayırmak için Hücre Ayrılma Tampon (CDB) kullanılmasına izin verir bu yana, fibronektin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 (BSA, İnsülin, Transferrin)	Reaktif	Kök Hücre Teknolojileri	09500
Antibiyotik-Antimikotik	Reaktif	İnvitrojen	15240-062
DMEM: F12 (1X)	Reaktif	İnvitrojen	11330-032
EMEM (1X)	Reaktif	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Fisher tarafından belirtilen katalog altında dağıtılan #
Fetal Sığır	Serumu Reaktifi	Invitrogen	10437-028
FGF, insan bazik rekombinant	Reaktif	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	Reaktifi	PeproTech Inc	100-00AB
EGF, insan rekombinant	Reaktif	BD Biosciences	CB40052	Fisher tarafından belirtilen katalog altında dağıtılmıştır #
Hücre Kültürü Şişesi, 25 cm2	Alet	Corning	10-126-28	Fisher tarafından belirtilen katalog altında dağıtılmıştır #
Fibronektin, insan, doğal	Reaktif	BD Biosciences	CB40008A	Fisher tarafından belirtilen katalog altında dağıtılmıştır #
İnsan Nöral Kök / Öncü Hücreler	Hücreler	Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynağı
Hücre Ayrışma Tamponu	Reaktifi	Invitrogen	13150-016