$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Sinyalizasyon komplekslerinin hücre içi dağıtım tanımlama karmaşık çıkış anlamak için şarttır. , Immunoprecipitation konvansiyonel yöntemlerle komplekslerin uzamsal lokalizasyonu hakkında bilgi vermemektedir. BiFC aksine, etkileşim ve protein kompleksleri sar compartmentalization izler. Bu yöntemde, bir fluororescent protein, amino ve karboksi-terminal sonra iki protein ilgi erimiş olmayan floresan parçalarının içine ikiye bölünmüş durumda. Fluorofor sulandırma (Şekil 1) 1,2 proteinlerin etkileşimi. BiFC bir sınırlaması parçalanmış fluorofor sulandırılmış bir kez karmaşık 3 geri dönüşümsüz olmasıdır. Bu sınırlama, geçici ya da zayıf etkileşimleri tespit avantajlı, ama karmaşık dinamiklerin bir kinetik analizi engellemektedir. Ek bir uyarı sulandırılmış flourophore yine gerçek zamanlı etkileşimler 4 gözlem engelleyen, olgun ve floresan için 30 dakika gerektirir. Protein etkileşimleri 5,6: BiFC,, yeşil floresan protein çeşitleri olarak muhabir proteinleri (BiFC), dihidrofolat redüktaz, b-laktamaz ve protein ölçmek için lusiferaz istihdam protein parçası tamamlama yöntemi (PCA) belirli bir örnek . Protein çalışmak için alternatif yöntemler: hücrelerinde protein etkileşimleri floresan co-yerelleştirme ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) 7 içerir. Eş-lokalizasyonu için, iki protein ayrı ayrı, doğrudan fluorofor veya dolaylı immünofloresan ya etiketlenir. Ancak, bu yaklaşım, co-lokalizasyon verileri yorumlamak zor olmayan etkileşim proteinlerin yüksek arka yol açar. Buna ek olarak, konfokal mikroskobi çözünürlük sınırları nedeniyle, iki proteinin mutlaka etkileşim olmadan co-lokalize görünebilir. BiFC ile ilgi iki proteinin etkileşime girdiğinde, floresan sadece görülmektedir. FRET protein çalışmak için başka bir mükemmel bir yöntemdir: protein etkileşimleri, ama teknik olarak zor olabilir. FRET deneyler, donör ve alıcı hücrede benzer bir parlaklık ve stokiyometri olması gerekir. Buna ek olarak, bir donör yoluyla alıcısı kanal ve tersi içine kanama için hesaba katmalısınız. FRET aksine, BiFC, küçük bir arka plan görüntü verilerini floresan, küçük işleme sonrası yüksek aşırı ekspresyonu gerektirmez ve zayıf veya geçici etkileşimler algılayabilir. Biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret), donör, böylece heyecan verici bir alıcı bioluminescent olmak için bir substrat katalize bir enzim (örneğin lusiferaz) dışında FRET benzer bir yöntem. Bret teknik sorunlar, kanama ve yüksek arka plan floresan yoksun ama özel bölmeleri 8 substrat lokalizasyonu eksikliği nedeniyle mekansal bilgi sağlama yeteneğine yoksundur . Genel olarak, BiFC bölümlere sinyalizasyon içgörü kazanmak için protein kompleksleri hücre içi lokalizasyonu görselleştirmek için mükemmel bir yöntemdir.