$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Nicotiana benthamiana tesisleri 25 ° C sıcaklık kontrollü bir büyüme odasında yetiştirilmektedir. 3-6 hafta eski bitkilerin tam genişletilmiş sağlıklı yaprakları kullanılır.
İpucu: yeni gelişmekte olan yaprakları kullanarak daha iyi sonuçlar elde edilir
1. Agrobacterium geçici infiltrasyon protokolü:
1. Gün
- Agrobacterium tumefaciens (zorlanma LBA4404), hücre ölümü için çalışılmalıdır gen (ler) ve vektör içeren uygun vektörler içeren gliserol stokları ile Streak LB / Rifampisin (25 mg / ml) / Kanamisin (100 mg / ml) agar plaklarına kurucu organizatörü altında GUS kaseti. Daima negatif kontrol olarak boş bir vektör kontrolü içerir.
- 28 ° C'de 2 gün süreyle inkübe edin.
3. Gün
- Rifampisin (25 mg / ml) ve Kanamisin (100 mg / ml) içeren LB / Rifampisin / Kanamisin plakası önceden çizgili her LB tek bir koloni ile 2 ml inoküle edin.
- 28 sallayarak ° C 24 saat boyunca 200 rpm'de maksimum büyüme yoğunluğu ulaşana kadar her kültür inkübe edin.
İpucu: Topaklanma bazen durumda kültürleri iyice ilerlemeden önce (yani, yukarı ve aşağı pipetleme) yeniden süspanse olması gereken görülmektedir.
4. Gün
- Inkübasyon sonrasında, toplam hacmi 10 ml taze LB (uygun antibiyotik içeren) ve acetosyringone (son konsantrasyon 25 mcM) artırır.
- 28 ° C'de 16 saat sallayarak her kültür inkübe edin.
5. Gün
- Ertesi gün oda sıcaklığında 10 dakika için 4000 xg'de 10 ml (acetosyringone katmayan) infiltrasyonu, orta (10 mM MgSO 4 .7 H 2 O, 9 mM (MES), pH 5.6) ve santrifüj ekleyerek her kültürün iki kez yıkayın.
- Son santrifüj adım sonra, 5 ml infiltrasyon orta acetosyringone (100 mcM) içeren her kültürün tekrar süspansiyon haline getirin.
- OD 600Nm ölçün, 0.1 ve 0.9 arasında ölçüm kabul edilebilir.
İpucu: OD 600Nm 0,1 gibi düşük bir sorun olmadan kullanılan, ancak daha yüksek ODS daha tutarlı sonuçlar doğurabilir. - Enfeksiyon için Agrobacterium kültürleri hazırlamak için 3 saat daha kültürleri inkübe edin.
- Analiz edilmesi için gen (ler) ve negatif kontrol (Agrobacterium boş vektör içeren) GUS kaset içeren kültürü ile 1:1 oranında karıştırın kültürleri içeren.
- 1 ml iğne şırınga (Şekil 1) kullanarak yeni ortaya çıkan yapraklar eksen dışı (altında) yan sızmak.
İpucu: negatif kontrol karışımı (boş vektör + GUS kaset) ve tersi aynı bitki yaprakları üzerinde test edilecek gen (gen x + GUS kaset) içeren karışım Infiltrate. Her tedavi için üç nüsha bitkiler kullanın. - Post-infiltrasyon tüketim 3 gün GUS protein ekspresyonu için yaprak test sızmış.
2. Histokimyasal GUS tahlil
8. Gün
- X-gluc substrat orta eksize yaprakları içine sızmak Vakum.
- Gece boyunca oda sıcaklığında veya belirgin mavi boyama görünene kadar karanlıkta inkübe edin.
Gün 9
- Distile su ile durulayın.
- Klorofil çıkarılana kadar sonra tekrar distile su aktarmak,% 70 etanol içinde inkübe edin. Görme GUS ifade düzeylerini değerlendirmek.
3. Florimetrik MUG tahlil:
8. Gün
- Sıvı azot kullanarak bir harç sızmış yaprak diskler taşlama ile total protein kesin. GUS ekstraksiyon tamponu 100 uL (50 mM NAPI pH 7.0, 10 mM EDTA,% 0.1 Triton X-100,% 0.1 N-lauroylsarcosine sodyum tuzu, β-mercaptoethanol (0.7 ul / ml) örnek buz tutarken.
- 4 ° C'de 5 dakika 14.000 gr süspansiyon Santrifüj ve toplam çözünebilir protein olarak supernatant almak.
- Üreticinin talimatlarına göre bir nanodrop kullanarak konsantrasyon ölçün.
- GUS ekstraksiyon tamponu kullanılarak her örnek için toplam çözünebilir protein 100 mg protein konsantrasyonu ayarlayın.
- 2 mM nihai konsantrasyonu GUS ekstraksiyon tamponu hazırlanan MUG substrat (4 methylumbelliferyl-β-D-glukuronid trihidrat) ekleyin. Numune başına 100 mcL (protein + MUG substrat) toplam hacmi yeterli olmalıdır.
- 37 1 saat için reaksiyonlar inkübe ° C
- GUS durdurma tamponu (0.2 M Na 2 CO 3) 800 ul ekleyerek reaksiyonlar durdurun.
- Dalgaboyu 365 nm ve 455 nm dalga boyu ve emisyon değerleri karşılaştırmak MU bir standart eğri bir floresan bir plaka okuyucu kullanarak ölçün. Nmol MU / mg protein / dak toplam çözünen GUS faaliyet raporu seviyeleri.
4. Hisse senedi ve Çözümleri:
- Acetosyringone (1 M) stok (FW = 196.2 g)
- Kanamisin (100 mg / ml) stok dH 2 0 hazırlamak - sterilize
- Rifampisin (25 mg / ml) stok hazırlama DMSO
- Luria-Bertani (LB) sıvı büyüme ortamı: (1L)
% 1 (w / v) bacto-Tripton, 10 g
% 0.5 'lik (w / v) bacto-maya özü, 5 g
170 mM sodyum klorür 10 g
pH 7 - Acetosyringone (25 mcM) = 25 ul son hacmi 1 ml 1 M stokunun
- Sızma Orta: (1L)
10 mM MgSO 4 0,7 dH 2 0 (FW = 246,48 g), 2,4648 g
9 mM MES (FW = 213,25 g), 1,91925 g
pH - 5.6 - Acetosyringone (100 mcM) = 100 ul son hacmi 1 ml 1M stokunun
- Gus Ekstraksiyon Tampon
50 mM NAPI pH 7.0, 10 mM EDTA,% 0.1 Triton X-100,% 0.1 N-lauroylsarcosine sodyum tuzu, β-mercaptoethanol (0.7 ul / ml) - 2x Fosfat tampon
0,2 M NaH 2 PO 4 ve 0.2 M Na 2 HPO 4 pH 7 - X-Gluc substrat çözeltisi
1 mg çözülür 5-bromo-4-kloro-3-indolyl 0.1 ml metanol BD-glukuronid (X-Gluc). 1 ml 2x fosfat tamponu, ferrisiyanür 20 ul 0.1M potasyum, 10μl Triton X-100% 10 ve 850 ul distile su ekleyin.
5. Temsilcisi sonuçları:
Hücre ölümü oluştuğunda, bu protokol sonrasında GUS ifade kaybı bekleniyor. Biz aynı anda sito koruyucu Arabidopsis Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) ailesinin bir üyesi ile β-glucuronidase muhabiri gen (GUS) ifade etmişlerdir . Biz co-sızmış N. benthamiana Agrobacterium suşu LBA4404 kullanarak 35S tahrik BAG ifade kaset ve GUS vektör pCAMBIA 2301 ile bırakır. Şekil 2'de görüldüğü gibi bu infiltrasyon, GUS boyama gözle görülür bir artış gözlenmiştir. Tersine, Bcl-2 ailesinin bilinen pro-apoptotik üyesi BAX iken, (Şekil 2) GUS boyama belirgin bir azalma gözlendi. Hem de bu gibi durumlarda, GUS ifade kontrol ile karşılaştırıldığında gözle görülür şekilde farklı oldu. Ancak, ifade arasındaki fark daha az belirgindir, florometrik MUG deneyleri GUS ifade quanitate gerçekleştirilen olabilir.
Şekil 1. Örnek N. eksen dışı tarafında Agrobacterium karışımı infiltrasyon benthamiana 1 ml iğne şırınga kullanarak bırakır.
Şekil 2. GUS vektör N. birlikte ifade edilmiştir. benthamiana anti-ölüm gen ve hücre ölümüne bilinen bir indükleyicisi ile bırakır. GUS düzeyleri, boş bir vektör kontrolü (GUS kontrol) karşılaştırıldı.