Bu iletişim, doğruluk ve tekrarlanabilirlik dsDNA ve protein kantitatif BioSpec-nano UV-VIS spektrofotometre veri sunmaktadır. Ultra-küçük birimler bile otomatik silme fonksiyonu, hacmi ve daha kesin sonuçlar için en az taşınmasını sonuçları artırıyor (1 ila 2 L), tekrarlanabilirlik, mükemmel.
Method Article
Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler
Opens in a new tab
In This Article
Summary
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Abstract
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Nükleik Asit kantitatif prosedürleri, son üç yıl içinde önemli ölçüde gelişmiş var. Daha fazla, moleküler biyologlar, deneyler için nükleik asit örneklerinin tutarlı küçük hacimli bir analiz gerektirir. BioSpec-nano sorunları özel optik ve hassas bir PDA dedektörü ile doğasında mevcut DNA kantitatif yöntemler yanlış, non-tekrarlanabilir sonuçlar, olası bir çözüm sağlar. BioSpec-nano fiber optik eleman ve manuel temizleme, sıkıcı tekrarlayan ve tutarsız yerleştirme da böylece ortadan kaldırarak, montaj, ölçme ve temizleme aracı tarafından yapılır böyle otomatik bir işlevselliğe sahiptir.
Bu çalışmada, veriler, DNA ve protein, ölçüm tekrarlanabilirlik ve doğruluk gibi miktarının sunulmaktadır. Otomatik numune temas ve hızlı tarama mükemmel verim, üç saniye ölçüm sağlar. Veri analizi yazılımı yerleşik özellikleri kullanarak yapılmaktadır. DNA konsantrasyonu hesaplamak için kullanılan formül:
Örnek Konsantrasyon = DF · (OD260-OD320) · NACF (1)
Nerede = örnek seyreltme faktörü ve NACF = nükleik asit konsantrasyon faktörü DF.
Nükleik Asit konsantrasyon faktörü 1 seçilen analit göre ayarlanır.
Protein konsantrasyonu sonuçları mcg / mL ya da e280 ve molekül ağırlığı değerleri sırasıyla girerek mol / L olarak ifade edilebilir. E280Calc sekmesinde Tyr, Trp ve Sistein (SS bağı) kalıntı değerleri girildiğinde, yok olma katsayısı değerleri e280 olarak hesaplanan 5500 = x (Trp artıkları) + 1490 x (Tyr artıkları) + 125 x (sistein SS bond) . E280 değeri yazılım tarafından konsantrasyonunun hesaplanması için kullanılır.
BioSpec-nano, nükleik asitler ve protein konsantrasyonu tayin ek olarak diğer birçok analitler için ultra mikro hacim spektrofotometre ya da 5 mm yollu hücreleri kullanarak, standart bir spektrofotometre olarak kullanılabilir.
Protocol
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. DNA kantitasyonu Prosedürü
- Cihazı ON açın.
- PC masaüstü BioSpec nano yazılımı açın.
- Basit Nükleik Asit-dsDNA sekmesinde (Şekil 1) üzerine tıklayın.
- Yazılım aracı ile iletişim kurmak ve bir başlatma sırası çalışacaktır. Bu cihazın özelliklerine göre performans olduğunu doğrular.
- 0.7 veya 0.2 mm yollu kaydırıcıyı seçin. Bu yollu seçer ve tüm hesaplamalar seçilen yollu dayanmaktadır.
- BioSpec-nano yazılımını tıklatın Setup Autowiping kurulum Next. 1 veya 2 seçeneğini seçin.
- Pipet 2 mcL (0.7 mm), H 2 O veya kaide tampon .
- Boş veya F6 boş ölçümü için tıklayın. Her zaman yeni yollu boş bir kayıt için gerekli olan seçilir.
- Pipet 2 mcL kaide üzerinde örnek.
- Başlat yazılım veya cihazın start düğmesine basınız tıklayın. Üst pencere örnek damlacık ile temas yapmak için harekete geçti. Xenon yanıp söner görülebilir.
- Tekrarlanabilirlik belirlemek için aynı örnek 3 kez tekrarlayın.
- Kaydedilen tüm veriler. Bud dosyası olarak kaydedilir.
- Pdf / csv veya F9 bir pdf veya. Csv dosyası olarak kaydetmek için Kaydet'i tıklatın. Sonuçlar ayrıca, kaydetme sekmesinde uygun seçimi kullanarak bir. Csv dosyası olarak kaydedilebilir.
2. Protein kantitasyonu Protokolü
- Protein kantitasyonu sekmesini seçin (Şekil 2).
- Eğer biliniyorsa, yok olma katsayısı e280 girin.
- E280 bilinmemektedir e280Calc kullanarak hesaplayabilirsiniz.
- 0.7 veya 0.2 mm yollu kaydırıcıyı seçin.
- Setup Autowiping kurulumu tıklayın. 2 seçin veya yukarıda.
- Pipet 3 mcL (0.2 mm), H 2 O veya kaide tampon .
- Boş veya F6 boş ölçümü için tıklayın.
- Pipet 3 mcL kaide üzerinde protein örnek.
- Başlat yazılım veya cihazın start düğmesine basınız tıklayın.
- Tekrarlanabilirlik belirlemek için aynı örnek 3 kez tekrarlayın.
- Kaydedilen tüm veriler. Bud dosyası olarak kaydedilir.
- Pdf / csv veya F9 bir pdf veya. Csv dosyası olarak kaydetmek için Kaydet'i tıklatın.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
1. DNA kantitasyonu Sonuçları
Şekil 3 tipik bir çift iplikli DNA örneği üzerinde yapılan ölçümlerde elde edilen veriler göstermektedir. Konsantrasyon ve OD 260/280 oranı hesaplanır de gösterilir. Şekil 4 DNA kantitatif için tekrarlanabilirlik test sonuçları içerir. Şekil 3 ve 4 gösterileri sonuçları veri 0.26% düşük bağıl standart sapma belirgin olarak yüksek oranda tekrarlanabilir.
Not 1:
DNA kantitatif yanlışlığından UV bölgede absorbe tampon bileşenlerinin varlığı ortaya çıkabilir. Ayrıca homojen bir örnek çözümü kullanmak gereklidir. Pipetle numune miktarı, doğru ciltlik kabarcıkları giriş olmadan sadece 1-2 mcL dikkatli pipetleme olduğu için gereklidir.
2. Protein kantitasyonu Sonuçları
Şekil 5 BSA için protein konsantrasyonu analizi temsil eder. Mcg / ml protein konsantrasyonu e280 değeri dayanmaktadır. Şekil 6 tekrarlanabilirlik analiz gösterir. DNA için değil, aynı zamanda proteinlerin sadece BioSpec-nano tam konsantrasyonu ölçen 0.51% bağıl standart sapma açıktır.
Not 2: protein konsantrasyonu etkileyen faktörler
PH, tamponlar, sıcaklık veya katkı kaynaklanan istikrarsızlık itibaren en az etkileri vardır, doğru protein konsantrasyonu tespiti mümkün olmaktadır. En çok saflaştırılmış protein işleme çeşitli adımlar geçer; dolayısıyla protein damlacık oluşumu ile etkileyebilir yüzey veya diğer katkı maddeleri içerebilir mümkündür. Bu tür örnekler için, 5 mm yollu kuvars hücre kullanarak şiddetle tavsiye edilir.
Şekil 1, çift iplikli DNA kantitatif için analit seçim penceresi
Şekil 2 etiketli olmayan protein kantitatif analit seçim penceresi
Şekil 3 DNA kantitatif Temsilcisi veri
Şekil 4 Tekrarlanabilirlik veri DNA kantitatif
Şekil 5 protein kantitatif veri Temsilcisi
Şekil 6 protein kantitatif veri Tekrarlanabilirlik
Discussion
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
BioSpec-nano DNA kantitatif yöntemleri doğasında mevcut sorunlar, tutarsız sonuçlar ve sıkıcı el emeği çözmek için tasarlandı. Her ölçüm deneyimli bir moleküler biyolog, bir dakika içinde 3-6 hakkında birden fazla numune analiz etmek için izin, sadece 3 saniye sürer. Benzersiz silecek özelliği sadece ölçüm verimini artırır, aynı zamanda, ölçümler arasında ihmal edilebilir taşınmasını kaideleri manuel temizlik ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, 1000 ng / ml içeren DNA örnekleri için sadece 2 mendil kullanarak, testler, taşınmasını belirtilen en az 2 ng / mcL.
5 mm yollu hücre durumu seyreltik nükleik asit ve protein örnekleri analiz etmek için bir seçenek sunar ve diğer uygulamalar için bu alet kullanımı uzanır.
Disclosures
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Suja Sukumaran, Doktora Shimadzu bir çalışanın bu makalede yer alet yapar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| BioSpec-nano | Shimadzu Corporation | ||
| Buzağı Timus DNA | Sigma-Aldrich | ||
| Sığır Serumu Albümin | Sigma-Aldrich |
References
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).">Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).
- How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.">Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission