Biz, iyi tanımlanmış mikroçevresinin mekansal ve zamansal degradeleri üretebilir degrade üreten mikroakışkan cihaz mikroimalat için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, degrade üreten mikroakışkan cihaz yönlendirilmiş hücre göçü, embriyogenez, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı çalışma için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt
Bu makalede
Özet
Özet
Hücresel davranışlarının incelenmesi için bir degrade üreten mikroakışkan cihazın imalat ve işleyişi açıklanmıştır. Tam akışkanlar işlemek, yüksek verimli deneyler etkinleştirmek, ve istikrarlı çözünen konsantrasyonu gradyanlar oluşturmak için mikroakışkan bir platform sağlayan deneysel bir araçtır. Geleneksel gradyan jeneratörler, poli (dimethylsiloxane) (PDMS) ile karşılaştırıldığında tabanlı mikroakışkan cihazlar iyi tanımlanmış profiller ile istikrarlı büyüme faktörleri konsantrasyon gradyanlar üretebilirsiniz. Burada, üç ayrı girişleri ile basit degrade üreten mikroakışkan cihazlar geliştirdi. Üç mikro konsantrasyon gradyanlar oluşturmak için bir Mikrokanallı birleştirilir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) benzeri bir moleküler ağırlığı ile istikrar ve büyüme faktörü degradelerin şekli floresein isothyiocyanate (FITC)-dekstran tarafından teyit edildi. Bu mikroakışkan cihazı kullanarak, yüksek konsantrasyonlarda maruz fibroblastlar EGF konsantrasyonu degradelere doğru göç ettiğini göstermiştir. Göç eden hücrelerin hücre göç ve hareketlilik yön yönelimi kantitatif hücre izleme analizi ile değerlendirildi. Böylece, bu degrade üreten mikroakışkan cihaz göç eden hücrelerin davranışlarını incelemek ve analiz etmek için yararlı olabilir.
Protokol
A. mikroimalat mikroakışkan degrade üreten cihaz
- Si gofret, reaktif oksijen plazma (30W, harrick Bilimsel az 5 dakika, NY) ile tedavi edilir.
- Negatif fotorezist (SU-8 (50), Microchem, MA) Si gofret 1 dakika 1000 rpm'de spin-kaplı.
- Gofret yumuşak 65 pişirilmiş ° C daha sonra 95 ve 10 dak ° C 30 dakika bir ocak.
- Gofret UV ışığı (200W) en az 30 mikron özellik boyutu ile bir şeffaflık maskesi ile 3 dakika maruz kalmaktadır.
- Gofret 65 pişirilmiş yazılan ° C 1 dakika ve 95 ° C de 10 dakika.
- 100 mikron kalınlığında kanalları ile Si SU-8 fotorezist geliştirici ana kalıp kullanılarak geliştirilmiştir.
- Gofret mikro içeren bir Petri kabı içerisinde yerleştirilir.
- Poli (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) kalıplar, karıştırma silikon elastomer ve sertleştirici (10:1 oranı) tarafından imal edilir.
- PDMS karışımı Si ana kalıp üzerine dökülür.
- Si ana kalıp 10 dakika kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum desikatörde yerleştirilir.
- PDMS 1 ~ 2 saat boyunca 70 ° C'de kür.
- PDMS kalıpları Si ana kalıptan sıyrılır.
B. deney düzeneği
- Hücre giriş, çıkış ve beslerken girişler PDMS tabanlı mikroakışkan cihazın keskin zımbalama kullanarak açılmıştır.
- Geri dönüşümsüz bir cihaz ve bir cam slayt (2 × 3 inç) reaktif oksijen plazma (30W, harrick Bilimsel az 5 dakika, NY) ile yapıştırılır.
- Polietilen boru (PE 20, Becton Dickinon, MD) beslerken girişler mikroakışkan cihazın içine yerleştirilir ve daha sonra bir şırınga pompası bağlı.
- Floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran (MW = 10kD, 10 mcM, Sigma) ve tamponu (PBS, Invitrogen, CA) akışkan cihaz içinde istikrarlı gradyanlar onaylamak için mikroakışkan cihazın içine infüze.
- Ekstrasellüler matriks (ECM) (yani, fibronektin) 1 saat inkübatör (37 ° C), mikroakışkan cihazın içinde kaplanmıştır.
- NIH 3T3 fibroblast hücreleri tripsinize ve ayrışmış.
- Disosiye hücreleri hücre yoğunluğu 2 × 10 6 hücre / ml mikroakışkan cihazı (800 mm genişliğinde) yüklenir.
- 2 ml medya ve 50 ng / ml epidermal büyüme faktörü (EGF), bir şırınga pompası (0.05 ul / dk) kullanarak çözünen gradyanlar üretmek için bir mikroakışkan cihazın içine doluyor.
- Hücreler her 5 dakikada bir inverted mikroskop (Nikon TE 2000) kullanarak gerçek zamanlı takip edilmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücreler yüksek konsantrasyonlarda doğru göç eden bir mikroakışkan cihaz EGF istikrarlı konsantrasyon gradyanlar maruz. Hücre göçü, kemotaktik indeks, göç hücrelerinin motilite yönlü yönlendirme hücre izleme analizi ile araştırıldı. Bu nedenle, bu degrade üreten mikroakışkan platformu kanser metastazı, embriyogenez ve akson rehberlik eğitimi için yararlı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Dextran-FITC | Reaktif | Sigma-Aldrich | FD10S | Florescein izotiyosiyanat (FITC) konjuge dekstran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | insan rekombinan Epidermal büyüme faktörü | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimetilsiloksan) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negatif fotoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silikon wafer, 4 inç | |||
| Petri kapları | ||||
| Polietilen tüp | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | hücre hattı | fibroblast hücreleri | ||
| İnverted mikroskop | Nikon Instruments | TE 2000 |
Kaynaklar
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
