Biz Amerikan pika gösterildiği gibi, verimli bir şekilde zor küçük memeliler saç örnekleri toplamak için bir non-invaziv örnekleme yaklaşımı sunuyoruz. Biz örneklenmiş saç DNA açılan ve yaban hayatı ekolojisi ve korunması çalışmalarında yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçler çeşitli yükseltme bu yöntemin yararını göstermektedir.
Yöntem makalesi
Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği
Bu makalede
Özet
Özet
Noninvaziv genetik örnekleme yaklaşımları yaban hayatı popülasyonları çalışma için giderek daha önemli hale gelmektedir. Bir dizi çalışmada, popülasyon genetiği ve vahşi popülasyonlar 1 demografi araştırmak için non-invaziv örnekleme teknikleri kullanılarak bildirdin . Bu yaklaşım, nadir veya zor türlerin 2 ile uğraşırken özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır . Bu yöntemlerden bir dizi örnek saç, dışkı ve diğer etobur ve orta ölçekli memelilerin biyolojik madde için geliştirilmiş olsa da, büyük ölçüde zor küçük memeliler denenmemiş kaldı. Bu videoda, bir roman, ulaşılması zor bir küçük memeli, Amerikan pika (Ochotona princeps'in) hedef ucuz ve noninvaziv saç tuzak mevcut. Biz web benzeri bir biçimde düzenlenmiş ve pikas 'yaşam alanı seyahat rotaları boyunca yerleştirilen bant ambalaj şeritleri oluşan saç tuzak, set-up genel açıklar. Biz büyük bir miktar sonra toplanır ve laboratuara geri getirdi saç toplama tuzak etkinliğini göstermektedir. Daha sonra DNA izole etmek ve nükleer Mikrosatellitlerin amplifiye parça uzunluk polimorfizmi (AFLPs), mitokondriyal dizileri (800bp) yanı sıra da dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçler yükseltmek için bu yöntemi, yardımcı vitrin DNA IQ sistemi (Promega) kullanımını göstermek bir moleküler cinsiyet tayini işaretleyici. Genel olarak, yaban hayatı nüfus biyologlar için bir örnekleme tekniği olarak bu romanı noninvaziv saç tuzak yararını göstermektedir. Biz bu yaklaşımın doğal popülasyonları içinde çalışma organizmaların etkilerini en aza indirerek, araştırma alanları açılması, küçük memeliler çeşitli için geçerli olacağını tahmin ediyoruz.
Protokol
1. Saç tuzak
Bir tuzak kurmak için önce, ideal bir konuma pika habitat veya talus eğimi içinde belirlenecek. Bu hayvanlar yaz sonu gibi tuvaletleri sitelerinde bulunan taze scats topladığımız bitki örtüsü önbelleklerini saman yığınları içerir. Şeritler ambalaj bant (uzunluğu 10-50cm), 360 derecelik bir yapışkan bir yüzey sağlamak için alınır ve zarf pika saman yığını (Şekil 1) veya tuvalet sitenin girişinde bir web gibi bir şekilde düzenlenmiştir. Misina kayaların yapılandırmasına bağlı olarak, bir parça saç tuzak yapısını desteklemek için kullanılır, fakat bu girişleri, tam olarak bir açıklama kullanımı oldukça küçük (çapı <30cm) çoğu zaman gerekli değildir. Henry ve Russello (2010) 3 misina bulunabilir. Saç tuzaklarına mümkün olduğunca sık kontrol ve bant (Şekil 2) saç örnekleri üzerinde biriken sonra toplanan ve etiketlenir. Laboratuara bir kez geri taşınır, saçlar daha fazla manipülasyon kadar steril forseps kullanarak yapışkan bandı kaldırılmış ve kriyojenik tüpler aktarılır ve -20 ° C'de saklanır. Bağımsız kümelenmiş örnekleri farklı bireylere ait olduğu kabul edilir bir saç tuzak boyunca bir araya kümelenmiş Saç örnekleri, tek bir bireye ait olduğu kabul edilir. İkinci durumda, saç farklı tüpler yerleştirilir. Bu varsayımlar, daha sonra mikrosatellit genotipik verilere göre DNA parmak izi ve kimlik olasılık hesabı yoluyla test edilebilir.
2. DNA ekstraksiyonu
Pika saç çok ince ve çok küçük bir kök ampul içerdiğinden, daha önce en az 25 kılların kaliteli downstream PCR 3 için yeterli miktarda DNA elde etmek için gerekli olduğunu göstermiştir . Biz DNA IQ sistemi (Promega, Madison, WI, USA) ve kıl örneklerinden DNA izolasyonu için üreticinin talimatlarına biraz değiştirilmiş bir versiyonu kullanıldı. Öncelikle, saç örneği tüp açarken saç kaybını önlemek amacıyla bir mikro santrifüj eğirilir. Daha sonra kuluçka çözüm Proteinaz K. Kuluçka 0.1 M DTT ve 1.8ng/ml bir final konsantrasyon neden DTT 10μl (1M) ve 10μl, proteinaz K (18ng/ml) ile 80 ul inkübasyon çözüm karıştırılarak hazırlanır solüsyonu (100 ul) örnek eklenir ve 56 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edilir. Bu arada, lizis çözüm 0.01m son bir DTT konsantrasyon, lizis tamponu her 100 ul DTT (1M) 1 ul ekleyerek hazırlanır. Hazırlanan lizis solüsyonu (200 ul), daha sonra 7 ul DNA IQ reçine ile birlikte, örnek, yüksek hızda 3 saniye için vortekslenmiş ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe. Örnek sonra 2 saniye boyunca vortekslenmiş ve manyetik boncuk çözüm ayrılması meydana gelen manyetik standı, takılmış. Sonra kalan çözüm emişli ve atılır, manyetik reçine pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak. Örnek sonra hazırlanan lizis çözüm vortekslenmiş ve ayrılık yeniden oluşursa manyetik stand döndü 100 ul ile tedavi edilir. Aspire lizis tamponu ve atılır ve bu adımı yıkama tamponu (100 ul) kullanarak üç kez tekrarlanır. Örnek daha sonra, 15 dakika boyunca manyetik stand kurumaya bırakılır. Kuruduktan sonra, 100 ul elüsyon tampon örnek eklenir ve 65 ° C'de 5 dakika inkübe. Örnek vortekslenmiş ve manyetik stand içine eklenir. Yıkandı, DNA içeren bir çözüm daha sonra 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarılır ve daha fazla manipülasyonlar kadar -20 ° C'de saklanır. Karaciğer örneklerinden DNA DNA IQ sistemi kullanılarak ayıklanır ve PCR için bir pozitif kontrol olarak kullanıldı.
3. PCR
Noninvaziv saç tuzak ve karaciğer örnekleri elde edilen DNA, sonra yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçlerin (mikrosatellit, AFLP, mitokondriyal sitokrom B ve ZFX / ZFY cinsiyet tayini işaretleyici) bir paketi yükseltmek için kullanılır. - 20 ng DNA, her astar 0.5 mcM, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM 10: PCR içeren 25 mcL hacmi Veriti termal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) kullanılarak yapıldı KCl, 1.5 mM MgCl 2, 200 mcM dNTP, 10 μ sığır serum albumini (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, ABD) ve 0.5 U AmpliTaq Gold DNA polimeraz (Applied Biosystems). Mikrosatellit lokus'u Bisiklete binme parametreleri (95 10 dakika bir gol bisiklet programı kullanılarak optimize edilmiştir ° C, 95 ° C - 30 s, 30 s tavlama az 35 kür, 45 sn ve 72 ° C, 72 son bir adım ° C 10 dk). 1 azalarak tavlama ° C sıcaklık döngüsü başına 60 ila 55 ° C kalan 29 döngüleri 55 devam altıncı döngüsü, hangi noktada ° C ulaşana kadar Mitokondriyal parçaları için Bisiklete binme parametreleri yukarıda açıklandığı gibi ama bir tavlama ile 35 döngü oluşturdu50 ° C sıcaklık Amplifiye Fragment Uzunluk Polimorfizm Bonin 4 tarafından açıklanan omurgalı genomların için protokol yapıldı. Son olarak, moleküler cinsiyet tayini HinfI restriksiyon enzim sindirimi 5 ZFX / ZFY lokusların PCR-RFLP yöntemi kullanılarak yapıldı. Sindirilir ZFX / ZFX parçaları içeren% 3 agaroz jel üzerinde 100 baz puan (bp) merdiven (New England Biolabs) yanında çalıştırmak iken mikrosatellit AFLPs ve sitokrom B dizileri PCR ürünleri, ABI 3130XL genetik analizör (Uygulamalı Biyosistem) üzerine çalıştırmak % 2.5 SYBR Güvenli DNA jel leke (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ve KIRMIZI kişisel bir jel görüntüleme sistemi (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) kullanılarak görüntülenebilmekte. Mikrosatellit ve AFLPs Genemapper v3.7 (Uygulamalı Biyosistem) ve mitokondriyal DNA kromatogram kullanarak Sequencher v4.7 (Gen Kodu Corporation, Ann Liman, MI, USA) kullanılarak görüntülendi görüntülendi.
4. Temsilcisi sonuçları
Bizim noninvaziv tuzak kullanılarak elde edilen saç örneklerinden çıkarılan DNA PCR moleküler belirteçler çeşitli tip yükseltmek için kullanılmıştır. DNA karşılaştırması için bir temel olarak karaciğer örnekleri saç örnekleri yanında amplifiye edildi kullanarak ayıklanır. Nükleer mikrosatellit lokus'u saç ve karaciğer örnekleri (Şekil 3) hem de başarılı bir şekilde amplifiye edildi. Karaciğer örnekler kullanılarak sinyal yoğunluğu daha fazla olmasına rağmen, bu genotip puanlama üzerinde olumsuz bir etkisi yoktu (Şekil 3). AFLPs (Şekil 4), mitokondriyal DNA dizilerinin (Şekil 5) ve ZFX / ZFY moleküler cinsiyet tayini işaretleyici (Şekil 6) kullanarak benzer sonuçlar elde edildi.
Şekil 1 noninvaziv bir saç tuzak bir örnek, bir saman yığını. Kadar rulo ambalaj bant şeritler, saman yığını girişinde içine bir web gibi moda düzenlenmiştir. Misina bir parça saç tuzak için ek destek sağlamak için kullanılır.
Şekil 2'de ambalaj bandı sıkışmış saç çok sayıda içeren bir başarıyla saç snare
Şekil 3 bir temsilci nükleer mikrosatellit kromatogram (Ocp6) 8 Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) görüntülenir. Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA ile elde edilen ve bu lokus (354/358) heterozigot idi. Alt kromatogram saç çıkarılan DNA dayalı bir heterozigot genotip (358/362) sergileyerek farklı bir kişi temsil eder. Saç örneği kromatogram sinyal karaciğer örneği daha düşük bir yoğunluğu olsa da, genotip puanlama sinyal bu fark olumsuz etkilenmez.
Şekil 4 temsilcisi AFLP kromatogram (E31T32) Genemapper v3.7 (Uygulamalı Biosystems) görüntülenir. Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA elde edildi, alt kromatogram saç çıkarılan DNA temsil eder.
Şekil 5 Sequencher v4.7 (Gen Kod Corporation) görüntülenen bir temsilci, mitokondriyal DNA dizisi kromatogram (sitokrom B). Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA elde edildi, alt kromatogram saç çıkarılan DNA temsil eder.
Şekil 6, karaciğer ve saç örnekleri için yükseltilen temsili moleküler cinsiyet tayini işaretleyici (ZFX / ZFY) . Bu yaklaşım, Y kromozomu X kromozomu yoksun olduğunu, bu bölgede bir HinfI kısıtlama sitenin sahip olduğu gözlemine dayanır. Erkeklerde ise 432 bp, 261 bp ve 171 bp parçaları üreten Böylece, kadınlarda 432 bp iki ortak göç parçaları üretir.
Tartışma
Noninvaziv genetik örnekleme çeşitli nedenlerden dolayı geleneksel canlı yakalama yöntemleri için cazip bir alternatif haline gelmiştir. Birincisi, öne çıkmayan vahşi popülasyonlar biyolojik madde (örneğin, dışkı, tüyler, tüy, tükürük ve mukus) toplayarak, araştırmacılar, böylece hem hayvan ve araştırmacılar risklerin azaltılması, taşıma, hatta onları gözlemleyerek, rahatsız etmeden bu tür eğitim görebilirsiniz. İkincisi, zor ve nadir türlerin popülasyonlarında, daha geleneksel canlı tutucu yaklaşımları 6 ile zor bir görev noninvaziv genetik örnekleme çalışma biyologların sağlar. Ve üçüncüsü, NGS potansiyel böylece popülasyon parametreleri 7 tahminleri önyargıları en aza indirmek için yardımcı rahatsızlık hayvanlar, numune alma çabaları ve maliyetleri azaltarak, örnek boyutlarını artırabilir. Tehdit altındaki türler ile uğraşırken nüfus parametreleri önyargılı tahminler uygunsuz yönetimi neden olabilir Bu son nokta, önemli olabilir.
Mevcut video makalede biz, bir örnek olarak Amerikan Pika, zor küçük memeliler örnek, basit, roman, ucuz ve noninvaziv bir yöntem kullanarak, açıklanmaktadır. Biz, bu non-invaziv örnekleme yöntemi, yakalama ya da ölümcül örnekleme yaşamak için cazip bir alternatif haline saç çıkarılan bu DNA mikrosatellit, AFLP, mitokondriyal ve cinsiyet tayini belirteçler açısından karaciğer örneklerden çıkarılan DNA benzer şekilde gerçekleştirir göstermektedir. Genel olarak, çalışmanın altında canlılar üzerindeki etkisini en aza indirirken, bu yöntem, nadir veya zor küçük memeli türlerin genetik ve davranışsal çalışmalar nüfus veri toplama aşamasında yararlı olacağını tahmin ediyoruz.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. Hayhurst ve D. Kuch alanında yardım için teşekkür etmek istiyorum. K. Galbreath lütfen Bella Coola vadiden pika karaciğer örnekleri sağladı. Bu noninvaziv genetik örnekleme yöntemi tasarımına katkıda ilginç tartışmalar için, A. Gonçalves Da Silva ve K. Larsen teşekkür ederiz. Bu çalışma, Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi Kanada Keşif ve MAR UBC Okanagan Bireysel Araştırma hibe tarafından finanse edildi. İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Doktora Bursu PBSKP3_128523 PH desteklenir. Bu çalışma, British Columbia Üniversitesi (A07-0126 Sertifika numarası) hayvan bakım protokolü takip yapıldı.
Malzemeler
Saç tuzak:
- Net, ambalaj bandını Rolls (3M, St Paul, MN, ABD)
- Misina (£ 10)
- Kriyojenik tüp (2ml)
- Steril forseps
- Sıvı Azot Dewar (isteğe bağlı)
DNA ekstraksiyonu:
- Doku ve saç çıkarma Kiti (Promega Kat. # DC6740), DNA IQ Sistemi (Promega Kat. # DC6701).
- MagneSphere Teknoloji Manyetik Ayırma Standı (Kat. # Z5342; Promega)
- Mikro santrifüj
- Hibridizasyon fırın veya su banyosu
- 1.5 ml Eppendorf Tüpleri
Kaynaklar
- Kendall, K. C. Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population. J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).
- Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia. Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).
- Henry, P. In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger. Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).
- Henry, P., Russello, M. A. Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares. Eur J Wildlife Res. , (2010).
- Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395. , 145-145 (2005).
- Fontanesi, L. Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci. Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).
- Piggott, M. P., Taylor, A. C. Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species. Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).
- Banks, S. C. Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material. Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).
- Litvaitis, J. A. A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails. Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).
- Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps. Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).
Yeniden basım ve izinler
