Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Summary

Bu çalışma, MST araçları olarak önerilen insan / / sığır domuz DNA virüsleri, adenovirüs ve polyomaviruses, belirli bir miktar tayini için qPCR kullanarak suda nitrat dışkı / idrar kirlenme veya kontaminasyon kaynağının belirlenmesi için maliyet-etkin bir yöntem açıklanır.

Abstract

Ortamında mikrobiyal kirlenme önemli bir sağlık riski temsil eder. Klasik bakteri dışkı göstergeler önemli sınırlamalar olduğu gösterilmiştir, virüs bulaşma kaynağı bilgi birçok inaktivasyon işlemleri ve standart fekal göstergeler daha dayanıklıdır. Virüslerin su ve moleküler testlerin konsantrasyon için maliyet-etkin yöntemlerin geliştirilmesi, fekal kontaminasyon göstergeleri ve mikrobiyal kaynağı olarak izleme (MST) araçları gibi virüslerin uygulanabilirliği kolaylaştırır. Adenovirüsler ve polyomaviruses DNA virüsleri insanlarda dahil olmak üzere belirli omurgalı türlerin bulaşmasını ve ısrarla dışkı ve / veya incelenen tüm coğrafi bölgelerde idrar ile atılır. Daha önceki çalışmalarda, biz insan adenovirüs (HAdV) ve insan fekal kontaminasyonun bir göstergesi olarak kantitatif PCR (qPCR) JC polyomaviruses (JCPyV) miktarının önerdi. Son zamanlarda, biz por özel ölçümü için qPCR testleri geliştirdikcine adenovirüs (PAdV) ve büyükbaş hayvan fekal kontaminasyon belirteç olarak test tüpü başına 1-10 genom kopya hassasiyetleri polyomaviruses (BPyV). Bu çalışmada, biz bu araçları kullanarak su örneklerinde kirlilik kaynağını belirlemek için izlenecek prosedür mevcut. Temsili sonuçlar örnek olarak, yüksek düzeyde nitrat sunan yeraltı suyu virüs analizi gösterilmektedir.

Düşük veya orta derecede kirli sularda virüslerin tespiti çok daha küçük bir hacim, genellikle iki seri konsantrasyon adımları içeren bir prosedür en azından birkaç litre su virüslerin konsantrasyonu gerektirir. Bu biraz hantal bir prosedür ve viral kurtarma gözlenen değişkenlik su örneklerinin çok sayıda eşzamanlı işlem önemli ölçüde engel teşkil etmektedir.

Önceki Studie geliştirilen bir adım protokolü uygulanan iki adım yordamlar kaynaklanan darboğaz ortadan kaldırmak içins ve su matrisler bir çeşitlilik için de geçerlidir. Asitlenme on litre su örneklerinin, yağsız süt ile flokülasyon, topaklanmalara malzemelerin ağırlık sedimantasyon, çökelti ve santrifüj toplama, 10 ml fosfat tamponu çökelti, tabanda: Bu prosedür içerir. Viral konsantre viral nükleik asitler ve özel adenovirüs ve ilgi polyomaviruses qPCR tarafından sayısal çıkarılması için kullanılır. Çok sayıda numune eş zamanlı olarak bu düşük maliyetli konsantrasyon yöntemi kullanılarak analiz edilebilir.

Bu prosedür, suları, deniz suyu ve nehir suyu analiz uygulanmış ve bu çalışmada, yeraltı suyu numuneleri analiz sonuçları sunmak olmuştur. Bu yüksek verim nicel yöntem, basit, güvenilir ve maliyet-etkin.

Protocol

1. Viral parçacıkların konsantrasyonu su örneklerinde mevcut

1. Koleksiyon, klima ve su örnekleri
   1. En az 2 plastik kaplar içinde bir proses kontrolü gibi düz dipli ve bir ekstra numune örnek başına 10 L çoğaltır toplayın. Bu son örnek, bilinen bir viral parçacıkların miktarı ile çivili ve kontrol olarak kullanılan olacaktır.
      Not: Bu çivili numuneler için özel ayrı bir malzeme (şişe, tüp, vb.) Olması tavsiye edilir.
   2. Conductimeter kalibrasyon kontrol edin ve gerekirse yeniden kalibre. Bir ekstra 10 L plastik konteyner yeterli iletkenliği önceden ayarlanmış musluk suyu (1.6 aşağıya bakınız) kullanarak bir negatif kontrol hazırlayın.
   <....

Discussion

Tekrarlanabilir, güvenilir, basit ve maliyet-etkin açıklanan prosedürü rutin çevre ve halk sağlığı laboratuvarları için uygun bir yöntem için gerekli koşulları yerine getirecektir. Protokol basittir; ancak dikkatli bir şekilde takip edilmelidir. Flokülasyon için karıştırma süresi önemli ölçüde azalır (örneğin en az 5 saat) durumunda olacağı gibi, yapay deniz suyu tuzlarının istenen konsantrasyon eklemeden örneklerinde düşük iletkenlik virüs kurtarma önemli ölçüde azaltacaktır.

Şu anda .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yüksek hızlı santrifüj (8.000 xg)	Berckman Coulter	Avanti J-20XP
pH metre, termometre ve conductimeter	Afora	LPPC3003
Plastik borular 100-200 cm uzunluğunda	Deltalab	350059
Steril tek kullanımlık pipetler bitirdi	Labclinics	PN10E1
Steril plastik tüpler 1.5 ve 10-15 ml (Eppendorf, Şahinleri, vb.)	Afora	KA298/00
Santrifüj tencere (500 mL)	Fisher Scientific	SE5753512
Manyetik karıştırıcı ve mıknatıslar (başına birörneği)	Fisher Scientific	10510
Cam veya plastik kaplar, manyetik karıştırıcı kullanılmasına izin vermek düz dipleri	Deltalab	191642
Süpernatant (ya da bir su-jeti vakum pompası) kaldırmak için bir peristaltik pompa	Watson-Marlow	323E / D
Timer kapama 8-10 saat sonra karıştırma	Deltalab	900400
Hidroklorik asit (1N ve 0.1N)	Panreac	141020.1611
Sodyum hidroksit (1N)	Panreac	131687.1211
Suni deniz suyu deniz tuzu	Sigma	S9883
Yağsız süt (SM)	Difco	232100
Fosfat tampon pH 7, 5			01:02 v / v steril Na 2 HPO 4 0,2 M ve pH 7.5 NaH 2 PO 4 0,2 M
Tiyosülfat	Panreac	121879.1209	Su içinde% 10'luk bir çözüm olun.
QIAamp viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904
96-optik tepki plaka (500 adet)	Applied Biosystems	43426659
Optik yapışkanlı kapakları (100 adet)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan Çevre PCR Master Mix 2x	Applied Biosystems	4396838