Method Article

Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

DOI:

10.3791/2823

August 1st, 2011

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir In vivo Postnatal beyin gen fonksiyon testi yöntemi açıklanmıştır. Cre ve / veya floresan proteini ifade Rekombinant AAVs yenidoğan fare beyninin içine enjekte edilir. Mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme, gen fonksiyonu nöral devre geliştirme kritik süreçlerin hızlı analiz izin elde edilir.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normal beyin fonksiyonu, sinir devreleri olgunlaştı ve rafine zaman doğum sonrası gelişim üzerinde de sadece büyük nöronal yollarda kurulan embriyonik gelişim dayanır, ama. Bu aşamada Misregulation gibi otizm ve şizofreni 1,2 gibi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklara yol açabilir. Birçok genin prenatal beyin okudu ve birçok gelişim süreçleri 3-5 için çok önemlidir bulundu. Ancak, doğum sonrası beyin işlevi farelerde silinmesi genellikle neonatal gelişim sırasında ölümcül götüren kısmen ve erken gelişim kendi ihtiyacı postnatal analiz engellemektedir kısmen, büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu engelleri aşmak için, bu genlerin floxed allel farelerde 6 oluşturulan ediliyor. Ifade Cre recombinase belirli hücre tipleri, koşullu silme postnatal beyin gen fonksiyonu çalışma elde edilebilir ki transgenik allel ile birleştirildiği zaman. Ancak bu yöntem, böylece fare beyni büyük bir ölçekte genetik analiz genişleme sınırlama, uygun genotipler ile fareler üretmek için ek allelleri ve ekstra zaman (3-6 ay) gerektirmektedir.

Burada postnatal beyin geliştirme, hızlı ve sistematik bir şekilde bu floxed allel çalışma viral-ifade Cre kullanan tamamlayıcı bir yaklaşım göstermektedir. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) 7,8 kodlama Cre neonatal beyin içine enjekte edilerek, beynin farklı bölgelerinde ilgi gen silebilir. Viral titresi kontrol ve floresan protein işaretleyici coexpressing, biz aynı zamanda mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, erken geliştirme birçok genin gereksinimi, dallanma ve döşeme, sinaps oluşumu ve arıtmanın yanı sıra, atlar ve bize aksonal ve dendritik büyüme de dahil olmak üzere, doğum sonrası beyin gelişiminde çok kritik süreçlerin kendi hücre otonom fonksiyon, çalışma sağlar. Bu yöntem, kendi laboratuvarı (yayınlanmamış) ve diğerleri 8,9 başarıyla kullanılmaktadır ve lentivirüs 9 yanı sıra, shRNA veya baskın olarak aktif proteinlerdeki 10 ifade gibi diğer virüsler, uzatılabilir . Ayrıca, elektrofizyoloji bu tekniği birleştiren yanı sıra yakın zamanda geliştirilen optik görüntüleme araçları 11 genetik yollar fare ve sıçanlarda sinir devresi gelişimi ve işlevi nasıl etkilediğini incelemek için yeni bir strateji, bu yöntem sağlar .

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Enjeksiyon için hazırlanması virüsler

  1. rAAVs önerilen ticari bir satıcıdan satın alındı, ancak kişinin kendi laboratuarında imal edilebilir onlar da (aşağıya tartışma bakınız). Virüs çözümü genellikle mililitrede ~ 1x10 12 genom kopya (GC / ml) bir titrede üretilir ve tam titresi hücrelerinin çok sayıda işlemek için kullanılan olabilir. Alternatif olarak, seyrek etiketleme istenilen düzeyde üretmek için seyreltilmiş olabilir. Kullanıcı tarafından belirlenen uygun seyreltme gerekir, ancak 1:10 seyreltme başlanması tavsiye edilir.
  2. Kullanmadan önce buz üzerinde virüs hemen çözülmesini sağlayın. Virüs çözümü istenen ön sulandırma hacmi k....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yenidoğan viral enjeksiyon yöntemi, doğum sonrası beyin gelişimi ve çalışması için in vivo mozaikleri oluşturmak için basit ve hızlı bir şekilde sağlar . Bu yöntem yanı sıra şu anda proje 6 Hedefleme Yüksek Verimli Gen yoluyla alınıyor olduğunu mevcuttur floxed allellerin yararlanır . Cre transgenik ifade kullanımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem floxed allel taşıyan fareleri deneyler için doğrudan kullanılabildiği gibi, çeşitli hücre tipleri gen fonksiyonunu test etmek için hızlı .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma bir RO1 NIH (NINDS) hibesi ile desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktifin Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
rAAV8-Cre, GFP, DsRed Vektör Biolabs # 7060 # 7061, özel sipariş http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pompa 11 Plus Harvard Apparatus # 702.208 (Hayır ayak pedalı bağlantı noktası)
Retina pigment epiteli Enjeksiyon Kiti Dünya Hassas Aletler RPE-KIT Bağ boru, enjeksiyon iğneler (36G) ve iğne tutucu
NanoFil Şırınga, 100μl Dünya Hassas Aletler NANOFIL-100 Yeniden kullanılabilir yükleme iğne içerir
D-PBS Invitrogen 14040-117
GFP antikor Aves GFP-1020
DsRed antikor Clontech 632496
Isıtma Blok VWR 97042-610
ROSA26R fare Jackson Laboratuvarı 003309

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
  2. Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we goin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mosaic AnalysisVirus based Cre RecombinationPostnatal Brain DevelopmentConditional Gene DeletionAdeno associated Virus InjectionFluorescent Protein LabelingImmunofluorescence MicroscopyNeural Circuit DevelopmentAxonal Dendritic GrowthSynapse Formation Refinement

Related Articles