Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Özet

Bir In vivo Postnatal beyin gen fonksiyon testi yöntemi açıklanmıştır. Cre ve / veya floresan proteini ifade Rekombinant AAVs yenidoğan fare beyninin içine enjekte edilir. Mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme, gen fonksiyonu nöral devre geliştirme kritik süreçlerin hızlı analiz izin elde edilir.

Özet

Normal beyin fonksiyonu, sinir devreleri olgunlaştı ve rafine zaman doğum sonrası gelişim üzerinde de sadece büyük nöronal yollarda kurulan embriyonik gelişim dayanır, ama. Bu aşamada Misregulation gibi otizm ve şizofreni ^1,2 gibi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklara yol açabilir. Birçok genin prenatal beyin okudu ve birçok gelişim süreçleri ^3-5 için çok önemlidir bulundu. Ancak, doğum sonrası beyin işlevi farelerde silinmesi genellikle neonatal gelişim sırasında ölümcül götüren kısmen ve erken gelişim kendi ihtiyacı postnatal analiz engellemektedir kısmen, büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu engelleri aşmak için, bu genlerin floxed allel farelerde ⁶ oluşturulan ediliyor. Ifade Cre recombinase belirli hücre tipleri, koşullu silme postnatal beyin gen fonksiyonu çalışma elde edilebilir ki transgenik allel ile birleştirildiği zaman. Ancak bu yöntem, böylece fare beyni büyük bir ölçekte genetik analiz genişleme sınırlama, uygun genotipler ile fareler üretmek için ek allelleri ve ekstra zaman (3-6 ay) gerektirmektedir.

Burada postnatal beyin geliştirme, hızlı ve sistematik bir şekilde bu floxed allel çalışma viral-ifade Cre kullanan tamamlayıcı bir yaklaşım göstermektedir. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) ^7,8 kodlama Cre neonatal beyin içine enjekte edilerek, beynin farklı bölgelerinde ilgi gen silebilir. Viral titresi kontrol ve floresan protein işaretleyici coexpressing, biz aynı zamanda mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, erken geliştirme birçok genin gereksinimi, dallanma ve döşeme, sinaps oluşumu ve arıtmanın yanı sıra, atlar ve bize aksonal ve dendritik büyüme de dahil olmak üzere, doğum sonrası beyin gelişiminde çok kritik süreçlerin kendi hücre otonom fonksiyon, çalışma sağlar. Bu yöntem, kendi laboratuvarı (yayınlanmamış) ve diğerleri ^8,9 başarıyla kullanılmaktadır ve lentivirüs ⁹ yanı sıra, shRNA veya baskın olarak aktif ^{proteinlerdeki} 10 ifade gibi diğer virüsler, uzatılabilir . Ayrıca, elektrofizyoloji bu tekniği birleştiren yanı sıra yakın zamanda geliştirilen optik görüntüleme ^araçları 11 genetik yollar fare ve sıçanlarda sinir devresi gelişimi ve işlevi nasıl etkilediğini incelemek için yeni bir strateji, bu yöntem sağlar .

Protokol

1. Enjeksiyon için hazırlanması virüsler

1. rAAVs önerilen ticari bir satıcıdan satın alındı, ancak kişinin kendi laboratuarında imal edilebilir onlar da (aşağıya tartışma bakınız). Virüs çözümü genellikle mililitrede ~ 1x10 ¹² genom kopya (GC / ml) bir titrede üretilir ve tam titresi hücrelerinin çok sayıda işlemek için kullanılan olabilir. Alternatif olarak, seyrek etiketleme istenilen düzeyde üretmek için seyreltilmiş olabilir. Kullanıcı tarafından belirlenen uygun seyreltme gerekir, ancak 1:10 seyreltme başlanması tavsiye edilir.
2. Kullanmadan önce buz üzerinde virüs hemen çözülmesini sağlayın. Virüs çözümü istenen ön sulandırma hacmi küçük bir (~ 250μl) PCR tüp içine aktarın. Bir doku kültürü kaputu steril DPBS uygun bir hacmi kullanarak virüs çözümü sulandırınız. Sulandırılmış virüs çözümü gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın.

NOT: tüm virüsleri taşıma, kurum tarafından onaylanmış bir biyogüvenlik protokolü uyarınca yapılmalıdır

2. Şırınga yükleme ve ekipman montajı

1. Cam şırınga pistonu hafifçe çekerek yükleme iğne bağlayın ve PCR tüp virüs çözümü hazırlamak. Hava çok küçük bir kabarcık şırınga görülebilir kadar pistonu çekerek, bu çözüm şırınga ve yükleme iğne sol olmadığını gösterir. Alternatif olarak, küçük bir miktarda inert boya görünür hale getirmek için çözüm olabilir.
   NOT: küçük bir PCR tüp olarak kullanılmalıdır yükleme iğne genellikle çoğu diğer tüplerin alt ulaşmak için yeterince uzun değildir.
2. Kaldır yükleme iğne ve şırınga tutucu ile güvence, bir şırınga pompası şırınga blok şırınga.
3. Şırıngaya bağ hortumun bir ucunu nazikçe, iğne tutucu diğer ucunu takın. Iğne tutucu içine bir iğne takın. Enjeksiyon iğne ucu, doğrudan iğne tutucu bağ tüp içinde sonuna başvurmalısınız.
4. Yavaş yavaş bağ tüp yoluyla çözüm itmek için piston elle bastırın. Çözüm küçük bir damla, bir iğne ucu görünür kadar itin.
5. Dikkatle itici blok yanında piston konumu ve itici blok dirseğini ile sabitleyin.
6. Enjeksiyon parametrelerini ayarlayın: enjeksiyon oranı yaklaşık 8μl/min (~ 130nl / s); enjeksiyon hacmi genellikle 1-2ul; şırınga boyutu için (kılavuzlar için şırınga pompası kılavuzuna bakın) kullanarak uygun şırınga çapı seçin.
7. Ocak ayarlayın ~ 38 ° C ve iyileşme döneminde yavrular korumak için, bir kağıt havlu veya ince bir bariyer ile kaplayın.

3. Enjeksiyon prosedürü ve yavru kurtarma

1. P0 ve P1 fare yavrular, bir IACUC onaylanan protokole soğuk anestezi onlara tabi enjeksiyon için hazırlayın. Birkaç kağıt havlu, su ve buz üzerinde yer ile nemlendirin. Yavrular istenilen sayıda (4-5) (ayrı tutmak) kağıt havlu yerleştirin ve hafifçe nemli kağıt havlu ile kaplıdır, böylece yavrular üzerine kağıt havlu kat. Kağıt havlu üstüne hafifçe ezilmiş buz bir miktar yerleştirin ve yavrular yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe edin. Yavrular 15 dakika kadar buz üzerinde saklanır ve daha sonra ince kurtarmak olabilir.
2. Yavru yeterince uyuşturulduktan sonra, bir montaj bloğu yerleştirin (normalde 15ml tüpleri tutan plastik bir blok kullanın) ve enjeksiyon için en iyi erişim için pozisyon. Korteks için beyincik için blok kenarına yavru kafatasının arkasına daha iyi bir erişim sağlamak için baş pozisyonu yardımcı olur, karın hayvan düz koymak için en kolay yoldur. Istenirse yavru bir bant yardımı ile yerine sabitlenir olabilir.
3. Iğne elle diğer elinizle istediğiniz siteye kafatası yoluyla takılı iken tek elle yerde yavru kafa tutun. Enjeksiyon sırasında hareket etmesini engellemek için cildin sıkı çekmek için yararlıdır. Korteks için gelecek enjeksiyonları yardımcı olacak, kafatası lambda dikiş gibi iyi tanımlanmış bir anatomik işaretine göre enjeksiyonları yapmak için yararlıdır. Beyincik dokusu colliculus doğrudan kaudal yatan ince bir şerit olarak kafatası yoluyla görülebilir. Iğne takılı olmalıdır derinliği bireysel hayvanlar ve suşları arasında biraz değişir ve iğne üzerinde önceden belirlenmiş belirteçleri ile ölçülür olabilir, ancak biz korteks ve serebellum ~ 0.5 derinliği bulmak yüzeyinden 1mm genellikle uygundur. Diğer siteler için ekleme derinliği son kullanıcı tarafından deneysel olarak tespit edilmelidir.
   NOT: iğne kafatası kolayca nüfuz gerektiğini, yoksa bu hayvan zarar verebilir, çok zor TMEY. Iğne yeniden konumlandırmak ve yavaşça tekrar deneyin.
4. Virüs çözümü enjekte edilir. Enjeksiyon başlatmak.pompa START düğmesine basarak veya bir ayak pedalı karartıcı, enjektör kullanılan basınç model bağlı ed. Bir ayak pedalı yokluğunda bir meslektaşım enjeksiyon etkileyebilir gereksiz el hareketleri en aza indirmek için düğmeye basarak yardımcı olması tavsiye edilir.
5. Seçilen hacim enjekte edildikten sonra, birkaç saniye için iğne yerde tutmak ve daha sonra yavaşça yavaşça kaydırarak iğneyi çıkarın. Gereksiz hareketleri en aza indirmek için yavrunun kafasını tutmak için emin olun. Enjeksiyon ekipmanı temizlenmeli ve sterilize etanol ile deneyler arasındaki yara küçük olduğundan, antiseptik kullanımı gereksizdir.
6. ~ 38 sıcaklık set ile kapalı ocak yavru yerleştirin ° C kurtarma, genellikle 5-10 dakika kadar sıcak. Bu süre zarfında diğer yavrular enjekte devam edebilir.
7. Yavruların hepsi iyileşti sonra (bunlar pembe ve hareketli olmalıdır), ev yataklar bir kısmını almak ve yavrular hafifçe ovalayın. Bir grup olarak yavrular anne dönün.

NOT: Bu yavrular anne onları geri dönen ve bir grup olarak onlara geri dönmek için önce sıcak ve ev yataklar maruz emin olmak için çok önemlidir. Bunu yapmadığınız takdirde yavrular yaralanmasına ya da öldüren anne neden olabilir.

4. Ekipman temizliği

1. Enjeksiyon tamamlanır ve yavrular annelerinin iade edilmiş sonra, tam olarak aseton veya% 70 etanol ile şırınga yükleyerek enjeksiyon kurulum temiz. Her zaman taze solüsyon kullanarak çözüm, enjeksiyon kurulum birkaç kez yıkayın. Bu kalan virüs çözümü kaldırmak ve çökeltileri. Aseton veya etanol buharlaşır.
   NOT: Aseton temizlik için tercih edilen, ancak kurulum siyanoakrilat yapıştırıcılar gibi herhangi bir aseton duyarlı bileşenleri kullanır, o zaman bu adımlar için% 70 etanol kullanın.
2. Biohazard uygun bir kap içinde, çamaşır suyu ve iptal atık ile çalışma alanı dezenfekte edin.

5. Analiz

1. IACUC onaylanmış bir ötenazi yöntemi kullanılarak istenilen yaşta hayvanların Kurban. Perfüzyon fiksasyon, özellikle yetişkin hayvanların enfekte nöronlar, daha sonra görselleştirme yardımcı olmak için tavsiye edilir.
2. Standart immün prosedürleri floresan sinyalini yükseltmek için kullanılıyor olabilir. Kısaca, PBS +% 1 Triton X-100 ile 100 mikron vibratome bölümleri yüzen permeabilize ve PBS +1% Triton X-100% 10 normal keçi serumu bloke. Bölüm 4 geceleme primer antikorlar ° C, yıkama ve engelleme ek çözüm engelleme inkübe edilir. Bölüm, sonra oda sıcaklığında 2 saat için sekonder antikor ile çözüm engelleme inkübe iyice yıkanır, kızaklar üzerinde monte edilmiş ve anti-solmaya montaj medya dakika muamele edilir. Cryosections etiketli nöronlar da görselleştirmek için kullanılabilir, ancak endojen floresan kaybolabilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Başarılı bir enjeksiyon prosedürü gözlemlenebilir doku hasarı veya hayvansal diğer kötü etkileri ile enjeksiyon yerinde bölgedeki nöronların sağlam enfeksiyonu üretecektir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, enfeksiyonun yayılmasını çeşitli anatomik siteleri rAAV8-Cre enjekte Cre-muhabiri fareler (ROSA26R) ¹² görülebilir. Korteks ve üstün colliculus gibi belirli bölgelerde, içine enjeksiyon, genellikle komşu bölgeler (Şekil 1A-B) minimal yayılması ile yerel enfeksiyonlar oluşturur. Yüksek titreye virüs çözümü kullanılması daha muhtemeldir (Şekil 1A) hipokampus gibi bitişik olan alanlarda, enfeksiyon yapar. ROSA26R muhabiri fareler (Şekil 1C-D) orta hat serebellar rAAV8 Cre enjeksiyon gösterildiği gibi, tipik olarak enjeksiyon yeri yakınında kalır seyrek enfeksiyon düşük titreye virüs çözümü sonuçları, Enjeksiyon. Biz muhabiri genler enfeksiyon, rekombinasyon ve ifade nispeten hızlı bir şekilde oluşabilir düşündüren, rAAV8-Cre enjeksiyondan sonra 2 gün içinde ROSA26R muhabiri farelerde rekombinasyon gözlemledik. Ayrıca, başarılı floxed koşullu allel olmayan bir ROSA lokustaki gen silme etkilerini incelemek amacıyla bu tekniği kullandık, sonuçları başka bir yerde ilan edilecektir.

Enfekte hücrelerin sayısı enjekte viral çözüm titresi ile ilişkili olmalıdır. Örneğin, yüksek titresi çözümleri, beyincik farklı floresan proteinleri ifade iki rAAV8 virüslerinin bir karışımı enjekte farklı (Şekil 2A) etiketli birçok Purkinje hücreleri bozar. Aksine, düşük titresi virüs solüsyon enjekte tek hücre (Şekil 2B) görselleştirmek yardım etmek için seyrek enfeksiyona neden olabilir. Floresan etiketli nöronlar taze kesilmiş, canlı doku (Şekil 2B) doğrudan gözlenemeyen veya geniş alan veya ortak, daha sonra görüntü elde etmek için endojen floresan sinyalleri güçlendirmek için immün tabi tutulabilirnOdak floresan mikroskobu (Şekil 2A, Şekil 3A-C). Son olarak, rAAV8 ince süreçlerin güçlü etiketleme (Şekil 3A-C) ile kortekste nöron tipleri çeşitli bulaştırma yeteneğine sahiptir.

Şekil 1: P0 rAAV8-Cre enjekte edildi ROSA26R muhabiri farelerin beyin LacZ boyama Cre aktivite ve enfeksiyon yerini göstermektedir.

1. P14 beyin yüksek titresi (1x10 ¹² GC / ml), korteks ve üstün colliculus içine enjeksiyon gösteren bir geniş alan sagital görünüm . Yüksek titresi virüs komşu alanlarda aynı zamanda enfekte olacağını daha olası hale getirir.
2. Alt titresi (1x10 ¹¹ GC / ml) enjekte P14 korteksin sagital kesiti, virüs yaymak için daha az bir lokal enfeksiyon gösterir .
3. Düşük titreye sahip orta hat (1x10 ⁹ GC / ml) virüs çözümü enjekte P28 beyincik wholemount görünümü enfeksiyon seyrek ve genellikle enjeksiyon yerinde yakın kaldığını gösterir.
4. C beyinciğin orta hat sagittal görünüm). Genellikle sadece Purkinje hücreleri rAAV8 tarafından enfekte unutmayın.

Şekil 2: floresan proteinleri ifade rAAV8 yüksek ve düşük titreleri ile enjeksiyon Serebellar etiketleme.

1. EGFP (yeşil) ve DsRed (kırmızı) ifade eden bir karışımı iki virüs ile enfekte P21cerebellum sagital bölümü. Purkinje hücreleri çok sayıda enfekte virüslerin yüksek titresi karışımı kullanılmıştır.
2. Çok düşük titreye viral enfeksiyon canlı P14 beyincik Purkinje hücre diseksiyonu sonra hemen görüntülenmiş.

Şekil 3: rAAV8-DsRed Kortikal etiketleme.
P0 az rAAV8-DsRed bulaşmış olan bir P21 korteksin koronal bölümlerde çeşitli kortikal nöron tipleri örnekleri.

Tartışma

Burada sunulan yenidoğan viral enjeksiyon yöntemi, doğum sonrası beyin gelişimi ve çalışması için in vivo mozaikleri oluşturmak için basit ve hızlı bir şekilde sağlar . Bu yöntem yanı sıra şu anda ^proje 6 Hedefleme Yüksek Verimli Gen yoluyla alınıyor olduğunu mevcuttur floxed allellerin yararlanır . Cre transgenik ifade kullanımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem floxed allel taşıyan fareleri deneyler için doğrudan kullanılabildiği gibi, çeşitli hücre tipleri gen fonksiyonunu test etmek için hızlı ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
rAAV8-Cre, GFP, DsRed	Vektör Biolabs	# 7060 # 7061, özel sipariş	http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pompa 11 Plus	Harvard Apparatus	# 702.208	(Hayır ayak pedalı bağlantı noktası)
Retina pigment epiteli Enjeksiyon Kiti	Dünya Hassas Aletler	RPE-KIT	Bağ boru, enjeksiyon iğneler (36G) ve iğne tutucu
NanoFil Şırınga, 100μl	Dünya Hassas Aletler	NANOFIL-100	Yeniden kullanılabilir yükleme iğne içerir
D-PBS	Invitrogen	14040-117
GFP antikor	Aves	GFP-1020
DsRed antikor	Clontech	632496
Isıtma Blok	VWR	97042-610
ROSA26R fare	Jackson Laboratuvarı	003309