Method Article

Manyetik Rezonans Görüntüleme için hazırlanması, Saflaştırılması ve lantanide Kompleksleri Kontrast Ajanlar Kullanım Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/2844

⸱

July 21st, 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wayne State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz metalation, arıtma, ve lantanide komplekslerin karakterizasyonu göstermektedir. Burada açıklanan komplekslerinin manyetik rezonans görüntüleme kullanarak bu moleküllerin izlemeyi etkinleştirmek için makromoleküllerin konjuge olabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lantanide iyonları şelat tabanlı Polyaminopolycarboxylate ligandlar yaygın kullanılan ve ortaya çıkan komplekslerinin manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kontrast ajanlar olarak yararlıdır. Birçok ticari olarak kullanılabilir ligandlar, fonksiyonel, hızlı, yüksek saflıkta izin grupları ve amin-reaktif aktif esterleri ve izotiyosiyanat grupları veya tiol-reaktif maleimides üzerinden makromoleküllerin ve biyomoleküllerin yüksek getirili konjugasyon içerdiğinden özellikle yararlıdır. Bu ligandların metalation bioconjugation kimya, metalation prosedürleri ince farklar alanında ortak bilgi olarak kabul edilirken, metal başlangıç ​​malzemeleri seçerken dikkate alınmalıdır. Ayrıca, saflaştırılması ve karakterizasyonu var ve en etkili yöntemdir seçimi için birden fazla seçenek kısmen başlangıç ​​materyallerinin seçimine bağlıdır. Bu ince farklar yayınlanan protokoller genellikle ihmal edilir. Burada amacımız, metalation, arıtma, ve MRI (Şekil 1) kontrast ajanlar olarak kullanılabilir lantanide komplekslerin karakterizasyonu için ortak yöntemler göstermektir. Bu yayının, biyomedikal bilim adamları, başlangıç ​​maddeleri ve arıtma yöntemleri seçimi kolaylaştırılması lantanide kompleks reaksiyonlar sık ​​kullanılan tepkimelerin kendi repertuarına dahil olacağını bekliyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. LnCl 3 tuzları kullanarak Metalation

  1. 30-265 mM bir çözüm üretmek için ligand su içinde eritin. Bu video 73 mM konsantrasyonda ligand 2 - (4-isothiocyanatobenzyl) diethylenetriamine pentaacetic asit (DTPA-p-SCN-Bn) kullanılmıştır.
  2. 1 M NH 4 OH ekleyerek ligand çözüm pH 5.5 ve 7.0 arasında ayarlayın. Bu video, 0.2 mL 1 M NH 4 OH çözüm kullanılmıştır.
  3. 5-1000 mM bir konsantrasyon ile bir çözüm üretmek için su LnCl 3 1-2 benzerleri eritin. Bu video, EuCl 3 ve GdCl 3 111 mm konsantrasyonlarda kullanılır. Metal aşırı bir metalation genellikle tamamlanması için sürücü ve dolayısıyla arıtma basitleştirmek için kullanılır.
  4. Karıştırılırken LnCl 3 ligand çözüm çözümü ekleyin.
  5. LnCl 3 eklenmesinden sonra, 0.2 M NH 4 OH ekleyerek ortaya çıkan reaksiyon karışımının pH 5.5 ve 7.0 arasında ayarlayın. Bu video toplam 0.5 mL 0.2 M NH 4 OH çözüm kullanılmıştır. Ligand aside duyarlı fonksiyonel gruplar içeriyorsa, bu adımı sırasında pH birden çok kez ayarlayın. DİKKAT - çözüm çok basit olursa, herhangi bir temel duyarlı fonksiyonel gruplar, izotiyosiyanat gibi, konjugasyon için kullanılamaz hale olacaktır.
  6. PH ölçümleri ile reaksiyon izleyin. PH sabit kalır reaksiyon tamamlandı.

2. Raising pH tetkikleri (bu video dahil, ancak baz duyarlı fonksiyonel grupları olmaksızın ligandlar için iyi değil)

  1. ≥ 11 pH ayarlamak için reaksiyon karışımının NH 4 OH konsantre ekleyin. Bu adım, çözünmez hidroksit uncomplexed gibi herhangi bir metal hızlandırabilir.
  2. Filtre 0.2 mikron filtre ile süpernatantı. Reaksiyon karışımı filtre takunya, santrifüj ve filtreleme önce şişeden tavsiye edilir.
  3. Diyaliz gerçekleştirilmez ise, düşük basınç (döner buharlaştırma ya da dondurarak kurutma tavsiye edilir) altında çözücü kaldırmak.
  4. Serbest lantanide kalırsa Adımlar 2,1-2,3 tekrar edilebilir.

3. Diyaliz workup

  1. Ekstra uzunluğu (örnek hacmi yaklaşık% 10) bırakarak numune hacmi tutmak için uygun bir uzunluğu (üreticinin yönergeleri izleyin) diyaliz tüp kesin. Bu video, 100-500 dalton moleküler ağırlığı cut-off (MWCO) membran kullanılan, ancak büyük MWCO boru konjugasyon metalation önce yapılır uygun olarak kullanılabilir. Ayrıca, diyaliz kasetleri istenirse diyaliz tüp alternatif olarak kullanılabilir.
  2. Eğer üretici kurallarına göre uygun ortam sıcaklığında 15 dakika süreyle su kesme diyaliz tüp bekletin.
  3. Su (diyalizat) ile bir diyaliz rezervuar (1 L beher Bu video) doldurun. Diyalizat hacmi yaklaşık 100x örnek olmalıdır.
  4. Katlama bir iki kez tüp sonu ve bir diyaliz kapatma kelepçe ile boru katlanmış kısmı güvenli. Diyaliz sırasında kapalı kalmasını sağlamak için lastik bir bant ile kapatılması sonuna sarın.
  5. 0.2 mikron filtre ile reaksiyon karışımı Filtresi ve boru gözyaşı dikkatli olmak boru açık ucunu süzüntü yük. Tüp kapatmak için yeterli baş boşluk bıraktığınızdan emin olun.
  6. Iki kez, bir kapatma ile güvenli ve kapatılması adım 3.4 'deki gibi bir lastik bant ile sarın boru kalan açık ucunu katlayın.
  7. Bir lastik bant kullanarak diyaliz hortumun bir ucunu kelepçe hava içeren bir cam flakon takın. Diğer kelepçe kum içeren bir şişe takın. Bu şişeleri boru diyalizat dalmış kalmasını sağlar.
  8. Diyalizat içeren diyaliz rezervuar dolu tüp yerleştirin.
  9. Ortam sıcaklığında yavaş bir hızda (vorteks) manyetik bir heyecan plaka kullanarak diyalizat karıştırın.
  10. Bir gün ders (diyalizat Bu video, 2.5, 6.5 ve 11.5 saat olarak değiştirildi) üzerinde 3x diyalizat değiştirin ve sonra (20-28 saat diyaliz toplam) diyaliz gecede devam etmesine izin.
  11. Diyalizat diyaliz tüpünü çıkarın ve dikkatli bir örnek kaldırmak için bir kapatma açık. 3x diyaliz tüp su ile yıkayın ve numune yıkamalar birleştirmek.
  12. Düşük basınç altında su çıkarın. Bu video Dondurarak kurutma kullanılır.

4. Serbest metal varlığının değerlendirilmesi

  1. Metal kompleks çözülür asetat tamponu (buffer hazırlanması: 400 ml suya 1.4 ml asetik asit çözülür, 1 M NH 4 OH ile 5.8 pH ayarlamak ve toplam hacmi 500 ml su ekleyin) ve xylenol turuncu bir gösterge (16 mcM pH 5.8 tamponu). Bu video, 0.3 mg kompleks 0.3 mL tampon dağıldı ve 3 mL indikatör çözeltisi eklendi.
  2. , Menekşe sarı gösterge bir renk değişimi gözlem yoluyla serbest metal varlığını tespit.
  3. İsterseniz bir kalibrasyon eğrisi 1 oluşturarak, serbest metal miktarı belirlenebilir. Alternatif olarak, boya arsenazo III xylenol turuncu 2 yerine kullanılan olabilir. Serbest metal kalırsa, daha önce karakterizasyonu, diyaliz, bir tuzsuzlaştırma sütun veya yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) kullanarak saflaştırılmış örnek olmalıdır.

5. Su koordinasyon sayısı (q) Belirlenmesi

  1. H 2 O karmaşık (~ 1 mM) içeren III-Eu bir çözüm ve D 2 O. aynı konsantrasyonu başka bir çözüm hazırlayın Analizden önce, D 2 O çözümü kalan H 2 O. kaldırmak için üç kez buharlaştırılır ve D 2 O içinde çözünmüş olmalıdır
  2. Temiz bir küvet su çözeltisi ekleyin ve bir spectrofluorometer küvet yerleştirmek.
  3. Eksitasyon ve emisyon taramalar her (~ 395 nm ve 595 nm idi) maxima belirlemek için gerçekleştirin.
  4. Eksitasyon ve emisyon dalga boylarında adım 5.3, eksitasyon ve emisyon yarık genişlikleri (5 nm), flaş sayısı (100), ilk gecikme (0.01 ms), maksimum gecikme (13 ms) belirlenen aşağıdaki parametreleri kullanarak bir fosforesans zaman çürüme deney yapın ve gecikme artış (0,1 ms). Bu koşullar, en kompleksleri uygun, ancak azami gecikme ve artım değerleri son derece uzun veya çok kısa bir çürüme kez türler için artırılabilir veya azaltılabilir.
  5. Adım adım 5.1 'de hazırlanan D 2 O çözeltisi ile 5.4 tekrarlayın.
  6. 5.4 ve 5.5 'de elde edilen lüminesans-çürüme verilere göre, şiddeti zamana doğal günlük arsa. Bu satırların eğimi çürüme oranları (τ -1) (Şekil 2). Bu video, Microsoft Excel 2007, ham veri doğal günlük araziler oluşturmak için kullanılır oldu. Horrocks tarafından geliştirilen ve arkadaşları (eq 1) 3 denklemi çürüme oranları kullanın. Ligand metal koordine OH veya NH grupları varsa, o denklemi kullanmak 3 önce değiştirilmiş olmalıdır.

eq 1: figure-protocol-1

6. Relaksivite ölçümler

  1. T 1 (longitudinal relaksasyon zamanı) veya T 2 (transvers relaksasyon zamanı): relaksasyon zamanı analizörü istediğiniz uygulamayı modunu seçin.
  2. Gd farklı konsantrasyonlarda III içeren sulu bir çözücü kompleks içeren örneklerin bir dizi hazırlayın. Bu video, su, 0.625, 1.25, 2.50, 5.00, 10.0, solvent ve çözümleri olarak kullanılan ve 0 mM hazırlanmıştır. Diğer sulu solventler veya tamponlar kullanılabilir, ancak boş olarak solvent kullanılması önemlidir olabilir. Son örnek hacmi, kullanılan cihaz için özeldir.
  3. Aracı bir örnek koyun ve alet (37 ° C Bu video) sıcaklık dengelenmesi için 5 dakika bekletin.
  4. T 1 ve T 2 (T 1 ve T 2 temsilcisi eğrileri Şekil 3'te gösterilmiştir) için düzgün bir üstel eğriyi elde etmek için yazılım parametrelerini ayarlayarak gevşeme zamanı (s birimleri) belirleyin.
  5. 6.3 ve 6.4 örnekleri boş da dahil olmak üzere tüm adımları tekrarlayın.
  6. S -1 birimleri ölçülen T 1 ve T 2 değerleri ters hesaplayın.
  7. T 1 -1 veya T karşı 2 -1 Gd III konsantrasyonu değerleri (mM birimleri) çizilir. Gd III içeren kompleksler higroskopik doğası nedeniyle, Gd III konsantrasyonu atomik absorpsiyon spektrofotometresi veya indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi kullanarak onaylayın. Düz bir çizgi ile arsa sığdır. Bir temsilci komplo Şekil 4'te gösterilmiştir.
  8. Monte hattının eğimi relaksivite (T 1 ve T 2, sırasıyla r 1 r 2) ve mM -1 s -1 birimleri vardır.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Tablolar ve Şekiller bölümünde bu protokolü adımları Temsilcisi veriler dahil edilmiştir. Protokolde belirtilen su koordinasyon sayısı ve relaksivite karakterizasyonu yanı sıra, nihai ürünlerin standart kimyasal teknikleri kullanılarak karakterize etmek için önemlidir. Eu III içeren kompleksler Şekil 5'te gösterilmiştir bileşik kimlik kütle spektrometresi, ve temsili kitle spektrumu Gd III tanı izotop desen kullanılarak elde edilebilir. Ayrıca, non-Gd III.

figure-protocol-2
Şekil 1 metalation ve saflaştırılması için genel şeması: Programı metalation ve nedenleri farklı arıtma yolları seçmek için genel bir prosedür resmeden .

figure-protocol-3
Şekil 2 Lüminesans yoğunluğu arsa: bölüm 5 yoğunluğu karşısında zaman doğal günlük Temsilcisi arsa. Hatları, su ve D 2 O çözümleri için edinilen benzer eğrileri yamaçları, Eu su koordinasyon sayısı III içeren kompleksler karakterize eq 1 ile kullanılır.

figure-protocol-4
Şekil 3 Gevşeme çürüme zaman eğrileri: (sol) T 1 ve (sağda) T 2 satın alma Temsilcisi veri. Bu eğri şekilleri sapmalar güvenilir veri üretmek.

figure-protocol-5
Şekil 4 relaksivite belirlenmesi: Gd III konsantrasyonu karşı 1 / T 1 bir temsilci arsa. Monte hattının eğimi relaksivite ve mM -1 s -1 birimleri vardır.

figure-protocol-6
Şekil 5 Kütle spektrumları: tanı izotop desen gösteren Temsilcisi kütle spektrumları (sol) Gd III (sağda) içeren kompleksler ve Eu III içeren kompleksler. Siyah Gauss doruklarına teorik izotop dağılımı temsil eder ve kırmızı çizgiler gerçek verilerdir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lantanide bazlı kontrast ajanlar 4-14 yayınların sayısının artması göz önüne alındığında, bakım, hazırlama, arındırıcı ve tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir sonuçlar sağlamak için ürün karakterize alınması çok önemlidir . Bu kompleksler, genellikle arındırmak ve paramanyetik doğa ve bioconjugation için kullanılan olabilir herhangi bir fonksiyonel grupların duyarlılığı nedeniyle organik moleküllerin göreceli karakterize zorlu kabul edilir. Biz lantanide komplekslerinin sentezi, saflaştırma ve karakterizasy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz minnetle Wayne State Üniversitesi (MJA), Amerikan Yaşlanma Araştırma (SMV) Vakfı hibe ve Kariyer Bağımsızlık Geçiş Biyomedikal Görüntüleme National Institute Ödülü (R00EB007129) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Biyomühendislik Pathway başlangıç ​​fonları kabul Sağlık (MJA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktifler ve Ekipmanları Şirket Katalog numarası
EuCl 3 • 6H 2 O Sigma-Aldrich 203.254-5G
p-SCN-Bn-DTPA Macrocyclics B-305
amonyum hidroksit EMD AX1303-3
Spectra / Por Biotech Selüloz Ester (CE) Diyaliz Membran - 500 D MWCO Fisher Scientific 68-671-24
Millipore IC Millex-LG Filtre Üniteleri Fisher Scientific SLLG C13 NL
xylenol turuncu tetrasodyum tuz Alfa Aesar 41379
asetik asit Fluka 49199
D 2 O Cambridge İzotop Laboratories, Inc. DLM-4-25
su arıtma ELGA Purelab Ultra
yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi Shimadzu LCMS-2010EV
relaksasyon zamanı çözümleyicisi Bruker mq60 minispec
UV-vis spektrofotometre Fisher Scientific 20-624-00092
dondurarak kurutma makinası Fisher Scientific 10-030-133
pH metre Hanna Instruments HI 221
spectrofluorometer Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4
Molekül Ağırlığı Hesaplama sürümü 6.46 Matthew Monroe, indirilen 17 Ekim 2009 http://ncrr.pnl.gov/software/ Molekül Ağırlığı Hesaplama

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
  3. Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
  4. Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
  5. Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
  6. Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
  7. Major, J. L., Meade, T. J. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
  8. Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
  9. León-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
  10. Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
  11. Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
  12. Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
  13. Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
  14. Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
  15. Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
  16. Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
  17. Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
  18. León-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
  19. Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lanthanide ComplexesMRI Contrast AgentsMetalation ProcedureDialysis PurificationRelaxivity MeasurementsWater Coordination NumberFree Metal DetectionMass Spectrometry CharacterizationLuminescence Decay AnalysisRelaxation Time Analysis

Related Articles