Yöntem makalesi

Rat Beyin Dilimleri GABA-aktive Tek kanallı ve Tonik Akımlar

26.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/2858

⸱

17 Temmuz 2011

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, Sweden

Bu makalede

Özet

GABA-aktive tek kanal akımları (GABAA kanalları, GABAA reseptörleri) ve nöronlarda sinaptik üreten ve tonik akımları ölçmek için yama klemp tekniği kullanır. Sağlık ve hastalık kanalların aktivasyonu nöronal eksitabilite azaltır 1,2,3,4.

Özet

GABA Kanal A tüm nöronların ve onlar sırasıyla 4,5,6,7 GABA bir kanal pentameric GABA-kapılı klorür kanal fazik ve tonik akımlar oluştururlar sinaps sinaps ve dışında bulunmaktadır. Kanal alt birimden, 8 aile (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π ve ρ) gruplandırılmıştır. İki alphas iki betaları ve 3. altbirim fonksiyonel 8 kanal oluşturur. GABA bütün halkları nöron bir kanal da dahil olmak üzere çalışmaları ile alt türüne özgü GABA-aktive tek kanallı molekülleri çalışmaları birleştirerek temel nöronal inhibisyon mekanizması ve farmakolojik ajanları tarafından modüle nasıl anlamak mümkün olur.

Biz, hipokampal beyin dilimleri canlı nöronlarda GABA Kanal A fonksiyonel özellikleri çalışma ve tek kanallı ve tam hücreli akımları kaydetmek için yama klemp tekniği 9,10 kullanın . Biz kanalların daha farklı GABA konsantrasyonları, diğer ilaçlar ve içi ve hücre dışı faktörler tarafından nasıl etkilendiğini inceler. Patch-kelepçe yöntemi ayrıntılı teorik ve pratik açıklaması için, B Sakman ve E Neher 10 tarafından düzenlenen Tek Kanal Kayıtlar bakın .

Protokol

1. Beyin dilimleri Hazırlanışı:

22 gün eski Wistar rat - Deneyler, doğum sonrası 16 hipokampal beyin dilimleri üzerine yapılır.

  1. Hayvanlar yerel etik kurallara uygun ve onaylı hayvan bakım protokolleri dekapitasyon tarafından kurban.
  2. Bir spatula ile beyin hızla kaldırmak ve bir cerrahi bıçağı (# 24) ile orta hat boyunca kesmek. Whatman filtre kağıdı, kağıt bakan kesme her yarımkürede yerleştirin.
  3. Örnek diskte superglue bir damla koyun ve yarımkürede kesim yüzeyi aşağı bakacak şekilde üst üste yerleştirin. Kesme odasında buz gibi bir yapay beyin omurilik sıvısı ile doludur vibratome numune diski yerleştirin (ACSF, lütfen aşağıda 3.1 'e bakın).
  4. 400 mcM dilim kalınlığı ayarlama ve kesme beyinde başlar. Hipokampus ulaşmadan önce beyin dokusunun yaklaşık 2 mm kesmek gerekir.
  5. Hipokampal dilim ACSF ile dolu bir cam petri tabak içine konur. Hippocampi kolay görselleştirme izin plaka siyah bir arka plan (örneğin siyah kağıt) üzerine yerleştirilir. Çevreleyen dokudan keskin cerrahi bıçaklar kullanılarak hipokampus ayırın. Doku itmek ya da çekmek için dikkatli olun.
  6. Dilimler, sonra oda sıcaklığında saklanan ° 1s C ve deneyler kadar yapılan 37.0 ACSF çözüm inkübe edilir. Bir saatlik inkübasyon sırasında doku hasarı kesme işlemi uygulanan kurtarır.

2. Pipetler yama için hazırlanması:

  1. Pipetler borosilikat cam kapilerleri yapılır.
  2. Patch-pipetler, pipetler sonuçlanan, otomatik ya da manuel pipet Elcikler çekti 2 direnci - M tüm hücre kayıtları için 4 veya 8 - M 20 tek kanallı kayıtlar için uygun pipet çözüm ve ACSF banyo çözümü ile dolu (3.1, aşağıya bakınız).
  3. Tek kanallı kayıtları için kullanılacak pipetler, platin tel üzerinde oturan bir erimiş cam ısı yüzeyi pürüzsüz hale getirir bir microforge ile parlatılır. Aynı borosilikat cam gibi yama-pipetler tel cam damlacık oluşturmak için kullanılır. Pipetler deneyimlerimiz bu şekilde Parlatma kaplamasız bir tel ısı veya otomatik çektirmenin bir parlatma adım cilalı pipetler ile karşılaştırıldığında, daha istikrarlı ve daha yüksek bir direnç mühürler formu pipetler oluşturur. Pipetler Final büyüklüğü M 8 ile 20 arasında değişmektedir. Tüm hücre kayıtları kullanılan Pipetler cilalı değildir.

3. Deneylerde kullanılan Çözümleri:

Özel çözümler, tek kanallı ve tüm hücre kayıtları için kullanılır.

  1. ACSF mM içerir: 124 NaCl, NaHCO 3, 26 3 KCl, 1.3 MgSO 4, 2.5 Na 2 HPO 4, 2.5 CaCl 2, 10 glukoz ve pH 7.2 - 7.4% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile kabarmış . ACSF bazen de örneğin laktat 11 gibi diğer besin maddeleri ile tamamlanmaktadır.
  2. Tek kanallı kayıtlar: banyo solüsyonu ACSF veya mM ya: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1.8 CaCl 2 ve 10 TES (N-tris [hidroksimetil] metil-2-aminoethanesulfonic asit) pH 7.25 ve diğer ilaçlar özel deneyler için gerekli olabilir mM hücre bağlı ve iç-dış yamalar için pipet çözüm: 140 Kolin Cl, 5 NaCl, 1 KCl, 1 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 10 TES pH 7.25, 200 mcM saclofen (GABAB antagonist) ve 0 - 1 mcM GABA. Dış-mM yamaları: 140 NaCl veya Kolin Cl, 0.3 KCl, 2 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, 5 EGTA, 10 TES pH 7,2 - 7,4.
  3. Tüm hücre gerilim-klemp kayıtları: banyo çözüm: dilimleri (2-3 ml / dk) perfüze ACSF şimdi de kynurenic asit (3 mM) ve özel deneyler için gerekli olabilecek diğer ilaçlar içeren pipet çözüm içeren mM: 140 CSCL, CaCl 1, 2, 3 EGTA, 0.5 KCl, 1 MgCl 2, 2 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, 5 QX-314 bromür, CsOH ile 7.25 arasında 10 TES pH .

4. Patch-klemp deneyler için bir Giga Ohm (GΩ) mühür oluşturulması:

Hipokampal beyin dilimleri (Şekil 1A), U-şeklinde bir platin tel üzerinde naylon konuları kayıt odasının alt kısmında yapılmaktadır. CA1 ve 3 örneğin doku organizasyonu ve dentat girus bölge hipokampal dilimleri veya belirli hücreler görselleştirmek için, bir mikroskop gerekiyor. Çoğu laboratuarları, böylece bir doku bölgeler veya belirli hücreleri tanımlamak için izin 60X 10X arasında değişen hedefleri ile dik bir mikroskop kullanıyoruz. Ancak, hatta bir diseksiyon mikroskobu yama dilimleri için kullanılan ve daha sonra görsel olarak belirli bir hücre yama değil, bir bölgeyi belirlemekte ama. Bu tür yama "kör yama" olarak adlandırılır. Benn sonunda her iki durumda bir yama belirli bir alanda tek bir hücre. Başarı oranı her iki yöntem için de benzer. Inhibitör hipokampus başlıca hücrelerin hücre gövdeleri, hipokampus bütün altalanları ve katmanlar arasında dağılmış oldukça yapılandırılmış lamina (örneğin CA3/CA1 stratum pyramidale ve hipokampal beyin dilim parlak grup olarak tanımlanır) organize olmasına rağmen hücre gövdeleri toplam nöronal nüfusu 12 yaklaşık% 10'unu oluşturuyor internöronlar. Granül hücre veya piramidal nöron lamina yamalı olabilir, zaman zaman interneuron ya da glia, bu hücrelerin farklı elektriksel özellikleri (Hippocampus Kitabı 13) temel hücreleri ayırt edilebilirler.

  1. GΩ mühür oluşumu. Bu işlem sırasında cam pipet şekilde hücre membranı sıkıca bağlanmış ve farklı yama yapılandırmaları GABA-aktive hücre zarı kanallarının etkinliğini ölçebilirsiniz (4 ve 5, aşağıya bakınız) olur.
    Pipet tutucu pipet pipet hızlandırır kap koyun ve sıkın. Axoclamp amplifikatör 200B Ayarlar: V-kelepçe, Kazanç 2, Filtre 2 kHz, holding potansiyeli 0 mV ve PClamp yazılımı kullanılarak bilgisayar üzerinden deney yapıyorsun.
  2. Pipet tutucu ve ağızlık ve tüp arasında vanasını kapatın bağlayan tüp takılı olan ağız parçası haline üfleyin. Bu sizin pipet pozitif basınç oluşturur. Pipet pozitif basınç iki işlevi vardır; ilk, bir akış pipet gelecektir ve bir kez pipet pipet ucu temiz tutmak yardımcı olacak banyo çözüm girer. İkincisi, hücre zarının bir yama-pipet ile, nazik vakum uygulayarak yüksek kalite, yüksek direnç sızdırmazlık oluşturan önemli bir parçasıdır. Mühür, genellikle sadece pipet basınç kontrol vanası açılarak oluşturulabilir. Bu nedenle, herhangi bir hava kaçağı olmadığından emin olun. Pipet tutucu alarak kolayca sızıntı olup olmadığını test edebilirsiniz, ağızlık içine su ve darbe ile dolu bir beher içine batırın. Herhangi bir kabarcıkları kaçmak görürseniz o bölümü yeterince sıkı değildir.
  3. Banyo solüsyonu içine pipet indirin. Pipet direncini ölçmek bilgisayar ekranında 5 mV puls ve pipetin direnişi anlatan bir dizi tarafından oluşturulan bir kare darbe göreceksiniz. Daha az sayıda, daha büyük bir pipet açıklıkları, daha büyük pipetler temsil eder. 0 ofset pipet ayarlayın.
  4. Hücre zarı Sızdırmazlık. Üzerinde bir mühür formu bölge veya yama için gidiyoruz hücre, tanımlayın. Beyin dilim içinde bir dentat girus granül veya mikroskopta 10X büyütme kullanarak parlak bantlar olarak hipokampus CA1 ve CA3 piramidal hücre gövdesi bölgelerde (bkz. Şekil 1A) tanımlamak veya kullanarak bireysel yüzey piramidal nöronlar tespit 60X büyütme.
    1. Mikroskop göz parçaları ile baktığınızda sizin bölge / hücre ve pipet görecek şekilde odak noktası haline pipet getir.
    2. Sadece yukarıda ancak doku dokunmadan kadar kaba hareket manipülatör ayarları ve düşük pipet kullanarak bölge / hücrenin ortasında üzerinde pipet yerleştirin.
    3. Çok hafifçe manipülatör üzerinde hareket ince ayarları kullanarak bölge / hücrenin ortasında üzerine pipet düşük ve aynı zamanda bilgisayar ekranında izlemek ve takip pipet direnç. Pipet direncini daha büyük olmasını (yüksek numara) görene kadar pipet aşağı hareket edin.
    4. Şimdi, yavaşça pipet pozitif basınç valf açarak serbest bırakın. Bu nazik bir emiş ve genellikle giga-mühür (yüksek direnç mühür, GΩ) automatically.If formları miktarda, daha sonra, önceden uygulanan pozitif basınç ve Giga-Seal oluşturacak ağızlık emme geçerlidir .
    5. Şimdi sözde Hücre-portlu patch-klemp yapılandırma (bkz. Şekil 1b) elde edilmiştir. Pipet ve pipet tutucu gelen transientler iptal etmek için hızlı ve yavaş kapasitans tazminat ayarlayın. Bilgisayar ekranında artık düz bir iz göreceksiniz. Yüksek GΩ sızdırmazlık değeri, daha iyi sinyal-gürültü oranı tek kanallı kayıtları olacaktır.

Bazen hipokampal dilim içinde yama için avantajlı olabilir. Bazı durumlarda hücrelerin sağlıklı bir yüzeyde daha korunur gibi zaman olabilir. Ayrıca, böyle bir doku içinde nöronlar, yama tonik şimdiki nesil ekstrasellüler GABA konsantrasyonlarının etkisi olarak, hücresel fonksiyonları üzerindeki ekstrasellüler çevre etkileri okuyor bir avantaj olabilir. Yama işlemi o biri dışında yukarıda açıklandığı gibi aynı po bırakmazsitive basınç pipet, pipet ucu kadar dilim içinde.

5. Tam hücreli yapılandırma ve kayıt tüm hücre akımları oluşturulması:

  1. Hücre bağlı yapılandırma, pipet potansiyeli -60 mV değiştirebilir veya hücrenin istirahat membran potansiyeli yakın.
  2. Pipet, pipet sahibine bağlı ve aynı zamanda direniş ve hücre içine kırık sonra görünür kapasitans transientler değişiklik nota bilgisayar ekranında izlemek tüp yoluyla emme uygulayın. Bu sözde Tüm Hücre yapılandırma veya Tüm Hücre modu (Şekil 1B) olur.
    Hücre membran direnci, bir hücre tipi diğerine değişir ve membran kanalları ve kaç açık iletkenlik bağlıdır. Hücre zarının kapasitans hücre boyutu ile değişir. Emiş başlangıçta hafifçe olmalıdır ancak hücre daha yürürlüğe kırmak için zor ise uygulanabilir. Emme Bakliyat de kullanılabilir.
  3. Bazen, pipet ve hücre arasında gelişen direnç bir tazminat gereklidir. Bu seri veya erişim direnci (Rs veya Ra) tazminat denir ve amplifikatör üzerindeki bir kontrol düğmesi ile yazılım ya da elle yoluyla yapılabilir. Deneylerde Ra için telafi yok ama ilk erişim direnci% 25 daha fazla göre değişir deneyler reddedilir.
  4. Tam hücreli modunda kaydedilen GABA-aktive tonik akımları.

Hipokampal CA1 piramidal nöronları tam hücreli yapılandırmada biz tutma potansiyeli seti - 60 mV ve 5 - 10 dakika pipet çözüm hücre iç dengeye izin bekleyin. Bu süre zarfında kayıt kararlı hale gelir. Deney sırasında, seri direnç değeri takip edebilirsiniz.

Deneyler voltaj-klemp yapılan ve tüm hücre zarı kanallarının bir nüfus akımı ölçmek. Bir akımların fazik ve tonik doğası gereği GABA-aktive sinaptik ve extrasynaptic akımları ayırt edebilirler. Antagonist SR95531 tüm GABA A akımları engeller. Holding akım azalma, nöron mevcut GABA-aktive tonik düzeyini gösterir.

Biz dilim bağlıdır ekstraselüler ortam GABA GABA-aktive tonik akım ilgilenen biz normal hücrelerin yüzeyinde yama değil, dilim içinde hücreleri yok Kullandığımız agonistleri ve antagonistleri, Kanal A, banyo çözümü uygulanır GABA modüle ve dilim içinde hücrelere ulaşır. - Deney odasında çözüm akış hızı 2 3 ml / dk.

6. Kayıt tek kanal akımları:

Deneyler bağlı hücre, iç-dış-patch-klemp yapılandırma yapılır (aşağıya bakın) ve tek kanal molekülleri aracılığıyla kayıt akımları, tek kanal akımları. Axoclamp 200B, V-kelepçe, kazancı 500, filtre 2 veya 5 kHz Ayarlar. PClamp yazılımı ile pipet potansiyeli kontrolü, veri örnekleme hızı en az 100 μs ayarlamak ve akımlar kayıt. Sadece dilim kapsayacak şekilde, tek kanallı kayıtları gürültü en aza indirmek için banyo çözüm ses seviyesi düşük tutulmaktadır.

  1. Hücre Eklenmiş yapılandırma GABA-aktive kanalları. GΩ mühür, hücre ekli modunda zarının üzerinde yer almış ve pipet içine membran yama kanalları (bkz. Şekil 1B) kaydedebilirsiniz. GABA hücre zarı çapraz olarak, GABA yama kanalları etkinleştirmek için pipet çözüm konur. GABA-aktive Extrasynaptic kanalları birkaç dakika kadar bir gecikme ile etkinleştirin. PClamp içinde potansiyel pipet potansiyeli yani - yama potansiyeli = 40 mV, membran depolarize 40 mV olarak kaydedilir.
    Hücre bağlı modunda kayıt avantajı kanal kendi doğal ortamında ve normal hücre içi proteinler ve faktörler ile bağlantılı olduğunu. Dezavantajı yama karşısındaki mutlak istirahat membran potansiyeli ve potansiyel bilmiyorum kayıt ne potansiyeli tam olarak bilmiyorum, hem pipet potansiyeli ve hücre istirahat membran potansiyeli tarafından belirlenir.
  2. Inside-Out yapılandırma GABA-aktive kanalları. Pipet hücre bağlı modunda hafifçe kaldırın ve mikromanipülatörler ince hareketleri kullanarak yan ve dilim uzak taşımak. Artık iç-dış yama ve Inside-Out modunda kaydedebilirsiniz.
    (Bkz. Şekil 1B) pipetlendi içine membran yama kayıt. Hücre bağlı modu olarakkanalları etkinleştirmek için pipet çözümü GABA var. Ancak, ilaçlar, benzodiazepinler, barbitüratlar, propofol vb gibi çift katlı lipid çapraz pipet içine geçmek mümkün olacak gibi banyo çözümü uygulanmış ve kanalları modüle edilebilir [14]. Yama potansiyeli = pipet potansiyeli ve hücre bağlı modu gibi üst üste hiç istirahat membran potansiyeli olmadığından, yama potansiyeli-pipet potansiyel örneğin eşit sonra -40 mV yama PClamp içinde tutma potansiyeli ayarlarsanız potansiyeli tam olarak 40 mV.
    Iç-dış yapılandırma avantajı kanal özelliklerini etkileyen bir iç membran yüzeyine ilaçlar ya da enzimler uygulamak ve incelemek için. Iç-dış yama yapma gücü, dışarıdan yama oluşur daha kanal kompleksi için, bu yırtık-off yama yapılandırma oluşumu potansiyel olarak daha nazik yapan kanal membran ortamı için geçerli değildir (aşağıya bakınız) .
  3. Dış-Out yapılandırma GABA-aktive kanalları. Tam hücreli modu sizin mikromanipülatör ince hareketleri kullanılarak pipet yavaşça yukarı kaldırın ya da geri çekmek. Aynı zamanda bilgisayarınızdaki pencere yama özelliklerini görüntüler izleyebilirsiniz. Hücre uzak pipet çizmek kapasitans transientler yok göreceksiniz ve tekrar GΩ mühür olacaktır. Artık bir dış-yama oluşturdular ve Dış-Out modunda kaydedebilirsiniz.
    Şekilde hücre zarı, pipet ucu deliğinin üzerinde kapatılmış, membran içinde pipet iç ve orijinal dış membran (Şekil 1B), kayıt odasında karşı karşıya karşıyadır. Incelenmek üzere GABA ve diğer ilaçlar artık banyo çözümü çözülür. 40 mV PClamp tutma potansiyeli ayarlamak yama potansiyeli = sonra pipet potansiyeli tam hücreli modu örneğin gibi yama potansiyeli tam olarak 40 mV.
    Dış-çıkış modu avantajları membran potansiyelinin ne olduğunu ve membran orijinal dış yüzleri olarak kullanılacak ilaçların deneysel odası, banyo çözüm çözülür ve kolaylıkla uygulanan ve kanallar kapalı yıkanmış olabilir tam biliyoruz. Dezavantajları membran üzerinde mühür vardı ve bazı moleküller kaybolmuş olabilir veya yerel membran çevre bozuk olarak artık kanal, hücre içi ve hatta transmembran proteinler ve tam kanal işlevi için gerekli olabilir faktörler bağlı olabilir ki süreci. Ancak, birlikte, herhangi bir diğer yöntem ile bugün artık mümkün değildir, moleküler düzeyde kanal özelliklerini farklı yama yapılandırmaları diseksiyonu izin verir.

7. Sonuçları analiz:

Tek kanallı ve tam hücreli akımları PClamp yazılım ile analiz edilir. Biz Synaptosoft (GA, ABD) veya AXOGraph (Sidney, Avustralya) sinaptik olayların analizleri için.

8. Temsilcisi sonuçları:

Şekil 2A dentat girus granül nöron bir hücre bağlı yama 20 nM GABA konsantrasyonu ile aktive tek kanal akımları gösterir. Kanalın maksimum iletkenlik aktivasyon gecikme süresi 2 dakika ve 38 saniye ve maksimum iletkenlik pS 15 44 idi. Yama 40 mV depolarize oldu. Şekil 2B rat hipokampal nöronlar tonik ve fazik akımları BELİRLEME tam hücreli gerilim kelepçe mevcut kayıtların örneklerini göstermektedir. GABAA antagonisti SR95531 engeller extrasynaptic-(tonik) ve sinaptik oluşturulan (fazik) GABA-aktive akımları. (Ba) dentat girus nöron ve (BB) insülin CA1 piramidal nöron extrasynaptic kanalları (Ba, b) ve engelleme SR95531 tarafından indüklenen temel akım vardiya güncel tonik ifşa tedavi uygulanan GABAA antagonisti SR95531 (100 mcM) sinaptik akımların ortadan kalkması SR95531 blokları sinaptik kanalları (Bb). CA1 piramidal nöronlar bazal koşul altında nöronların fizyolojik insülin konsantrasyonları 4 GABA-aktive tonik akımlar geliştirmek maruz kaldığında, 6 tonik GABA-aktive akımlar var ama yok.

Şekil 1
Şekil 1A. Rat hipokampal beyin dilim, belirlenen bölgelerde CA1 ve CA3 piramidal hücre tabakaları ve dentat girus (DG) granül hücre katmanı B. Şematik yama klemp yapılandırmaları.

Şekil 2
Şekil 2A, 20 nM tarafından aktif bir sıçan hipokampal beyin dilim dentat girus granüllü hücre hücre bağlı bir yama GABA Tek kanal akımları. Holding potansiyeli depolarize 40 mV (pipet potansiyeli -40 mV). Yıldız (* 1. akım iz) tanımlayan akımlar daha hızlı zaman ölçeği (2 nerede gösterildiğinind mevcut iz) a. tutma potansiyeli -60 mV gerilim kelepçe modunda dentat girus granül hücre ve b. CA1 piramidal nöron sıçan hipokampal beyin dilim kaydedildi. B. Tüm hücre akımları alınmıştır. CA1 deneyler için, dilimler akımları kaydedildi önce oda sıcaklığında 2 saat için 1 nM insülin inkübe edildi.

Tartışma

Tüm hücre akım hücre aktif kanallar tarafından oluşturulan topluluk akımların temsil eder. Farmakoloji ve klorür geçirgenliği GABAA kanalları bu kanallar ile ilgili akımları tespit etmek mümkün kılar. Sinaptik kanalları ve extrasynaptic kanalların tonik aktivasyon aktivasyon geçici doğası, bu iki nüfus arasında bir nöron olarak ifade GABAA kanalları kolay bir farklılaşma sağlar. Ancak, sadece tek kanallı kayıtları bir tonik akımları oluşturur kanal moleküllerin kinetik özellikleri eğitim görebilirsiniz. 100 s içinde aktif hale sinaptik kanalların aksine, tonik GABAA kanalları GABA 4,7,15,16,17,18 uygulanan zaman dakika arasında bir gecikme ile aktive edilir. Bu, pek çok kanal özellikleri kanal sonuçları gecikmeli aktivasyon tüm hücre kayıtları kullanılarak incelenmiştir olamaz. Tek kanallı düzeyinde GABAA kanalları farklı alt popülasyonları değişen fonksiyonel ve farmakolojik özellikleri tespit edilebilir. Böylece, farklı yama klemp yapılandırmaları sunmak için ne bir avantaj alarak, ayrıntılı olarak, nöronlarda sinaptik tonik ve akımlar oluşturmak GABA-aktive kanallarının moleküler farmakoloji fonksiyonu ve çalışma mümkündür.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma, İsveç Araştırma Konseyi, Uppsala Üniversitesi ve Fredrik ve Ingrid Thurings Vakfı tarafından finanse edildi. ZJ EXODIAB ve Svenska Sällskapet för Medicinsk Forskning bir doktora sonrası dostluk düzenledi. Frank Lee Biz tekniği yardım için teşekkür ederim.

Malzemeler

Birkaç patch-klemp donanım ve yazılım sistemleri mevcuttur ve hepsi aynı temel ilkelerini kullanarak çalışır. Laboratuarımızda Axoclamp amplifikatörler ve PClamp yazılımı (Moleküler Cihazlar, ABD), bizim deneyler kaydetmek ve analiz etmek için kullanırlar. Bir diğer popüler marka Heka amplifikatörler ve yazılım (Heka Elektronik, Almanya)

Microforge: Narishige MF-830 (Japonya); Vibrotome: örneğin Leica VT1200S (Almanya) veya Chipping Aletleri vibrotome (UK); Mikroskop: Nikon Eclipse E600FN; su banyosu; mikromanipülatörler: özel yapılmış ve Narishige mikromanipülatörler (Japonya); Çektirme: DMZ evrensel (Almanya) veya Narishige PC-10 (Japonya). Elektrot cam: GC150F-15 (Harvard Apparatus, Birleşik Krallık).

Kaynaklar

  1. Pavlov, I., Savtchenko, L. P., Kullmann, D. M., Semyanov, A., Walker, M. C. Outwardly rectifying tonically active GABAA receptors in pyramidal cells modulate neuronal offset, not gain. J Neurosci. 29, 15341-15350 (2009).
  2. Chao, H. T., Chen, H., Samaco, R. C., Xue, M., Chahrour, M. Dysfunction in GABA signalling mediates autism-like stereotypies and Rett syndrome phenotypes. Nature. 468, 263-269 (2010).
  3. Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468, 305-309 (2010).
  4. Jin, Z., Jin, Y., Mendu, K. M., Degerman, E., Groop, L., Birnir, B. Insulin reduces neuronal excitability by turning on GABA(A) channels that generate tonic current. Plos One. 6, e16188-e16188 (2011).
  5. Nusser, Z., Mody, I. Selective modulation of tonic and phasic inhibitions in dentate gyrus granule cells. J Neurophysiol. 87, 2624-2628 (2002).
  6. Semyanov, A., Walker, M. C., Kullmann, D. M. GABA uptake regulates cortical excitability via cell type-specific tonic inhibition. Nat Neurosci. 6, 484-490 (2003).
  7. Birnir, B., Korpi, E. R. The impact of sub-cellular location and intracellular neuronal proteins on properties of GABA(A) receptors. Curr Pharm Des. 13, 3169-3177 (2007).
  8. Olsen, R. W., Sieghart, W. International Union of Pharmacology. LXX. Subtypes of gamma-aminobutyric acid(A) receptors: classification on the basis of subunit composition, pharmacology, and function. Update. Pharmacol Rev. 60, 243-260 (2008).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  10. Sakmann, B., Neher, E. The Single-Channel Recording. , 2 ed., Plenum Press. New York. (1995).
  11. Zilberter, Y., Zilberter, T., Bregestovski, P. Neuronal activity in vitro and the in vivo reality: the role of energy homeostasis. Trends Pharmacol Sci. 31, 394-401 (2010).
  12. Spruston, N., McBain, C. Structural and functional properties of hippocampal neurons. The Hippocampus Book. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. , Oxford University Press. Oxford. (2007).
  13. The Hippocampus Book. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. , Oxford University Press. Oxford. (2007).
  14. Eghbali, M., Curmi, J. P., Birnir, B., Gage, P. W. Hippocampal GABA(A) channel conductance increased by diazepam. Nature. 388, 71-75 (1997).
  15. Lindquist, C. E., Birnir, B. Graded response to GABA by native extrasynaptic GABA receptors. J Neurochem. 97, 1349-1356 (2006).
  16. Birnir, B., Eghbali, M., Cox, G. B., Gage, P. W. GABA concentration sets the conductance of delayed GABAA channels in outside-out patches from rat hippocampal neurons. J Membr Biol. 181, 171-183 (2001).
  17. Birnir, B., Eghbali, M., Everitt, A. B., Gage, P. W. B. icuculline pentobarbital and diazepam modulate spontaneous GABA(A) channels in rat hippocampal neurons. Br J Pharmacol. 131, 695-704 (2000).
  18. Birnir, B., Everitt, A. B., Gage, P. W. Characteristics of GABAA channels in rat dentate gyrus. J Membr Biol. 142, 93-102 (1994).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

GABA ile Aktive Olan Ak mlarTek Kanal KaydT m H cre Yama KenetlemeHipokampal Beyin KesitleriYama Kenetleme Tekni iGABA Konsantrasyon EtkileriSinaptik Ekstrasinaptik Ayr mTonik Fazik Ak mlarH creye Kenetli Konfig rasyonPipet Haz rlama
Rat Beyin Dilimleri GABA-aktive Tek kanallı ve Tonik Akımlar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.