Kisspeptin reseptör (KISS1R) Mutasyonlar hastalarda üreme bozuklukları ile ilişkilidir. Burada ilgi KISS1R GC-zengin dizisi de immunoprecipitation ve western blot reseptör bozulması yolu karakterize KISS1R yapıları kullanımı gibi mutasyonlar nasıl tanıtmak için açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Üreme Bozuklukları ile İnsanlardaki Belirlenen GC-zengin KISS1 Reseptör sırası genetik mutasyonlar Mutagenez ve Analiz
Bu makalede
Özet
Özet
Kisspeptin reseptör (KISS1R), ergenlik tetik ve yetişkinlik 1,2,3 üreme yetki düzenleyicisi olarak tanınan bir G-protein kenetli reseptör . Hastalarda tespit KISS1R iodiopathic hipogonadotropik hipogonadizm (İHH) 1,2 ve erken ergenlik 4 inaktivasyon mutasyonları ile ilişkili bulunmuştur. Bu mutant Fonksiyonel çalışmalar yanı sıra, bu reseptörün üreme yönetmelik altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir hastalığın sonuçlarının şekillenmesinde bu anormal KISS1R sinyalizasyon ve işlevi sonucudur . Ancak, yüksek GC-zengin KISS1R gen dizisi oldukça zor mutasyonlar tanıtmak veya PCR ile bu reseptör kodlayan gen yükseltmek için yapar.
Burada, bu son derece GC-zengin sıra laboratuvarda bir düzine KISS1R mutantlar oluşturmak için başarıyla kullanılmaktadır ilgi mutasyonlar tanıtmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz değiştirmelerin, silme veya KISS1R sırayla eklemeler KISS1R mutant bir dizi amplifikasyon kolaylaştırmak için PCR koşulları optimize etmiş. Ayrıca, PCR arttırıcı çözüm yanı DMSO küçük bir yüzdesi olarak amplifikasyon geliştirmek için özellikle yararlıdır. Bu optimize yordam yanı sıra diğer GC-zengin şablonları için yararlı olabilir.
KISS1R kodlama ifade vektör mutasyonlar KISS1R işlevini değiştirmek ve ilişkili üreme fenotipleri yol nasıl anlamak için bu reseptör sinyalizasyonu ve fonksiyon karakterize etmek için kullanılmaktadır. Buna göre, site directed mutagenesis tarafından oluşturulan KISS1R mutantlar potansiyel uygulamaları, birçok çalışmada 1,4,5,6,7,8 gösterilmiştir . Örnek olarak, erken ergenlik ile ilgili KISS1R (Arg386Pro), kazanç fonksiyon-mutasyon KISS1R 9 bozulması oranı değiştirmek için reseptör ligand stimülasyon 4 gibi yanıt uzatmak gösterilmiştir . İlginçtir ki, çalışmalar en fazla G-protein reseptörler 9 açıklanan klasik lizozomal bozulması karşı KISS1R proteazom tarafından bozulmuş olduğunu göstermektedir. Burada sunulan örnekte, KISS1R bozulması, geçici Myc etiketli KISS1R (MycKISS1R) ifade İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri (HEK-293) incelenmiştir ve proteazom veya lizozom inhibitörleri ile tedavi. Hücre lizatları western blot analizi ile bir agaroz-konjuge anti-myc antikor kullanarak immunoprecipitated. Algılama ve leke üzerinde MycKISS1R ölçümü LI-COR Odyssey Kızılötesi Sistemi kullanılarak yapılır. Bu yaklaşım, çalışmanın yanı sıra diğer ilgi proteinlerin bozulması yararlı olabilir.
Protokol
1. Site-directed mutagenesis yüksek GC-zengin KISS1R gen sekansı
- Şablon: N-terminus'a erimiş bir Myc etiketi ile insan KISS1R tam cDNA dizisi. Bu dizi daha sonra transfections için kullanılan memeli hücre hatları ile uyumlu pCS2 + ifade vektörü, klonlanmış. Bu ifade, vektör pCS2 + Myc KISS1R gibi burada denir.
- Primer tasarımı: primerler Quikchange Site Yönetmen Mutagenez kiti (Stratagene) talimatlarına göre, istenen mutasyonlar taşımak için tasarlanmıştır. Özet olarak:
- Her ikisi de (ileri ve geri) primerler istenilen mutasyon içerir ve plazmid ters ipliklerini aynı sıra tavlama gerekir (örneğin, ileri ve ters....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Site-directed mutagenesis üzerinden üç yıl için hedef genlerin kodlama sırası nükleotid değişiklik protein fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Orijinal teknik, İngiliz, Kanadalı Kimyager ve Nobel ödülü sahibi Michael Smith 10 tarafından 1978 yılında tarif edilmiştir. Michael Smith Kary Mullis, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 11 icat eden Amerikalı biyokimyacı, 1993 Nobel Kimya Ödülü paylaştı. Yıllar boyunca Michael Smith tarafından açıklanan orijinal yöntem geliştirilmiştir. , Istenen gen.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Charles H. Hood Vakfı Genç Araştırmacı Çocuk Sağlığı Araştırma Ödülü (Boston, MA) - Bu çalışma, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (R21 HD059015 NICHD) Üreme Şubesi tarafından kısmen finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| 10x PCRx Enhancer Çözüm | Invitrogen | 52391 | |
| PfuUltra high-fidelity DNA Polimeraz Alternatif Deterjan | Stratagene | 600385 | |
| DPN-I | New England Biolabs | R0176 | |
| XL10-Altın Ultracompetent E. coli hücrelerinde | Stratagene | 200314 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal sığır serumu | Atlanta Biyolojik | S11550 | |
| Geneporter Transfeksiyon Reaktif | Genlantis | T201007 | |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MG132 | Calbiochem | 47491 | |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 | |
| Proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-24.948 | |
| Pierce BCA Protein Testi Kiti | Thermo Scientific | 23225 | |
| anti-Myc tag (klon 4A6) agaroz konjuge | Millipore | 16-219 | |
| 2x yükleme tamponu | BioRad | 161-0737 | |
| Kriter Tris-HCl prekast jel,% 4-15 oranında degrade | BioRad | 345-0028 | |
| Immobilon-FL PVDF membran | Millipore | IPFL00010 | |
| Odyssey Engelleme Tampon | LI-COR Biosciences | 927-40000 | |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 | |
| Tavşan anti-myc antikor | Hücre sinyal | 2272 | |
| Keçi anti-tavşan IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Odyssey Görüntüleme Kızılötesi Sistemi | LI-COR Biosciences | ||
| Halt Proteaz İnhibitör Kokteyl (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
Kaynaklar
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
