$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. PCOS Benzeri Fare Modeli Oluşturun
NOT: Bu çalışmada kullanılan fareler karışık bir arka plandı (C57 / B6, CD1, 129Sv) ve 24 ° C'de 14/10 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde yiyecek ve su ad libitum ile korundu.
- DHT Pelet Hazırlama
- Sterilize etmek için otoklav silastik boru. Silastik tüpleri bir tıraş bıçağıyla 15 mm uzunluğunda kesin.
- 3 mL'lik bir şırıngaya bağlı 20 G kör bir iğne ile tüpe tıbbi yapıştırıcı silikon enjekte ederek bir tarafı kapatın. Piston şırıngadan çekilmeli ve daha sonra rezervuara yapıştırıcı yerleştirilmelidir. Piston yeniden yerleştirilir ve yapıştırıcı iğneden çıkmaya başlayana kadar aşağı doğru itilir. Körelmiş iğne, 20 G iğnenin keskin uçlu tarafının herhangi bir güçlü makasla kesilmesiyle yapılır. Tüpteki silikonun uzunluğu, üretim sonrası kırpmaya izin vermek için 2 mm'den fazla olmalıdır.
- Gece boyunca kurulayın; kapalı tarafta hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. DHT peletleri için hava kabarcığı olmayanlar kullanılır. Diğerleri DHT içermeyen kontrol peletleri için kullanılabilir.
- DHT'nin cilde maruz kalmasını önlemek için bir başlıkta DHT peleti yapmadan önce eldiven, maske, gözlük ve laboratuvar önlüğü giyin.
- DHT tozunu plastik bir tartı teknesine dökün ve yapışkan kapaklı tüplerin (1.1.1'de üretilmiştir) açık tarafını DHT tozuna bastırın.
- DHT tozu, düzleştirilmiş büyük bir ataş ile sıkıştırılabilir. DHT 4 mm yüksekliğe (veya istenen uzunluğa) ulaşana kadar devam edin. DHT'nin uzunluğunu bir cetvelle kontrol edin ve açık tarafı silikonla kapatın, gece boyunca kurulayın.
- Silikonun uzunluğunu 2 mm uzunluğunda yapmak için her bir sızdırmaz tarafı kesin. Peletin toplam uzunluğu 8 mm olacaktır.
- Boş silastik borunun her iki tarafını da kontrol (DHT olmayan) pelet olarak kapatın.
- Peletleri kullanılana kadar oda sıcaklığında folyo ile sarılmış (ışığa maruz kalmayı önlemek için) 50 mL'lik konik bir tüpte tutun. DHT peletleri, en az 3 aylık depolama için tam etkinliğini korur.
- DHT Yerleştirme ve Değiştirme
- 20 DHT'ye kadar pelet veya kontrol peleti, yerleştirmeden hemen önce dengeleme için 37 ° C'de 24 saat boyunca 30 mL steril% 0.9 tuzlu su ile 50 mL'lik bir konik tüpe ayrı ayrı daldırılır.
- Ameliyat öncesi yüzeyler ve eldivenler clidox ile dezenfekte edilir ve çalışma yüzeyleri temiz plastik destekli emici kağıt (cerrahi ped) ile kaplanır. Hayvanlarla temas eden tüm aletler, hayvan tesisine girmeden önce otoklavlama ile dekontamine edilir. Aletlerin kullanımdan önce kurumasına ve soğumasına izin verilecektir.
- 2 aylık dişi fareler kullanılır (4-5 fare/kafes). Farelere bir insülin şırıngası kullanılarak intraperitoneal olarak Ksilazin (3.5 mg / kg vücut ağırlığı) ve Ketamin (78.8 mg / kg canlı ağırlık) enjekte edilir. Anestezi karıştırma ve dozlama hesaplamaları Tablo 1'de yer almaktadır.
- Ayak parmağı refleksinin kaybı ve yavaş nefes alma ile ölçülen yeterli anestezi sağlandıktan sonra, fare ameliyat için hazırlanacaktır.
- Steril gazlı bez kullanarak bölgenin cildini betadin ile dezenfekte edin ve% 70 etanol ile temizleyin. Alan tekrar betadin ile boyanacaktır.
- Boynun yakınındaki derinin altına makasla yaklaşık 5 mm uzunluğunda bir delik açın. 10 G'lik bir trokar kullanarak, rostral yönde küçük bir tünel (15 mm) yapın. Pelet, trokar ile dorsal olarak yerleştirilir.
- Açıklık daha sonra cerrahi yapıştırıcı ile kapatılır. Yaklaşık yara kenarlarına ince bir sıvı yapışkan film uygulamak için yara kenarlarını forseps ve hafif fırçalama darbeleriyle manuel olarak yaklaştırın. Yapıştırıcının yara üzerine eşit şekilde dağılmasını sağlamak için 3 ince yapışkan tabakası oluşturun. Yapıştırıcı, uygulanan yara kenarlarının her iki tarafında 1 cm uzanmalıdır. Deliği kapatmak için dikiş veya cerrahi klipsler de kullanılabilir. Fareleri, kurtarma için bir ısı yastığı ile ayrı ayrı yerleştirilmiş kafese geri koyun. Sabit bir androjen maruziyeti seviyesini korumak için peleti her 4 haftada bir değiştirin. Orijinal pelet çıkarılacak ve yeni pelet yukarıda açıklandığı gibi benzer bir konumda yerleştirilecektir.
| Ketamin
(100 mg / mL)
| Ksilazin
(100 mg / mL)
| tuzlu
(%0,9)
|
| 175 μL | 15 μL | 810 μL |
| Çalışma solüsyonunun intraperitoneal enjeksiyonu: 0.1 mL/20g vücut ağırlığı |
Tablo 1. Ketamin / ksilazin kokteyli.