Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. SE İndüksiyonu
- 8 haftalık erkek C57BL/6NHsd fareler satın alın ve her fareyi tartın. Ardından, SE indüksiyonu sırasında kolay tanımlanmaları için tüm farelerin kuyruklarını işaretlemek için bir işaretleyici kalem kullanın.
- Fare ağırlığına göre skopolamin metil bromür (skopolamin; 2 mg / kg), terbutalin hemisülfat (terbutalin; 2 mg / kg) ve pilokarpin hidroklorür (pilokarpin; 280 mg / kg) miktarını hesaplayın ve çözelti yapmak için salin (% 0.9 NaCl, 10 mL / kg) ekleyin.
NOT: Örneğin, farenin ağırlığı 25 g ise, aşağıdaki miktarlar uygulanır: Skopolamin ve terbutalin: 2 mg / kg * (25 g / 1.000 g) = 0.05 mg, Salin: 10 mL / kg * (25 g / 1.000 g) = 0.25 mL, Pilokarpin: 280 mg / kg * (25 g / 1.000 g) = 7 mg, Salin: 10 mL / kg * (25 g / 1.000 g) = 0.25 mL.
- Skopolamin ve terbutalin karışımını 30 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin. Solüsyonu her fareye intraperitoneal olarak enjekte edin ve ardından fareleri kafeslerine geri koyun. Skopolamin ve terbutalin uygulamasından 30 dakika sonra, her fareye pilokarpin çözeltisi enjekte edin (i.p.; 1 mL şırınga; 30 G iğne). Pilokarpin enjeksiyonundan hemen sonra, fareleri gözlem için bir inkübatöre (28-30 ° C) yerleştirin.
- SE indüklenene kadar farelerin davranışını dikkatlice izleyin. Racine ölçeğine göre evre 3 veya daha yüksek evre 3'e karşılık gelen limbik motor nöbetleri tespit edilirse, nöbetlerin daha sık meydana gelip gelmediğini belirlemek için zamanı kaydedin ve fareleri izleyin. Sürekli motor nöbetleri 2 dakikadan fazla sürdüğünde, fareyi oda sıcaklığında yeni bir kafese yerleştirin ve konvülsif nöbetlerinin devam edip etmediğini ve SE'nin indüklenip indüklenmediğini belirlemek için 3 saat boyunca izlemeye devam edin. Pilokarpin enjeksiyonundan yaklaşık 2 saat sonra SE'ye giremeyen farelere ötenazi yapın.
NOT: Racine'in ölçeği; aşama 1, ağız ve yüz hareketi; Aşama 2, baş sallama; evre 3, ön ayak klonusu; Aşama 4, ön ayak klonus ile yetiştirme; Aşama 5, ön ayak klonus ile yetiştirme ve düşme. Fare, SE indüksiyonundan hemen sonra oda sıcaklığında kafese aktarılmazsa, fare hipertermi nedeniyle ölebilir.
- SE başlangıcından 3 saat sonra diazepam solüsyonu (i.p.; 10 mg / kg; 1 mL şırınga; 30 G iğne) enjekte ederek davranışsal akut nöbetleri sonlandırın. Salin (i.p.; 10 mL / kg; 1 mL şırınga; 30 G iğne) ekleyerek 5 mg / mL diazepam % 10 polioksil 35 hidrojene hint yağı seyrelterek diazepam çözeltisini yapın.
NOT: %10 polioksil 35 hidrojene hint yağı çözeltisi: 1 mL polioksil 35 hidrojene hint yağı çözeltisi + 9 mL salin. Çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın. Örneğin, fare vücut ağırlığı 25 g ise, 250 μL diazepam çözeltisi enjekte edin: 50 μL 5 mg / mL diazepam + 200 μL% 10 polioksil 35 hidrojene hint yağı çözeltisi = 250 μL 1 mg / mL diazepam.
- Sahte fareler için, skopolamin metil bromür ve terbutalin hemisülfat karışımının (i.p.; her ikisi de 2 mg / kg, 10 mL / kg; 1 mL şırınga; 30 G iğne) bir ip enjeksiyonu yapın. 30 dakika sonra, salini intraperitoneal olarak enjekte edin (i.p.; 10 mL / kg; 1 mL şırınga; 30 G iğne).
NOT: Fare vücut ağırlığı 25 g ise, pilokarpin yerine 250 μL salin enjekte edin.
- Diazepam enjeksiyonundan sonra (i.p.; 1 mL şırınga; 30 G iğne), her bir fare başına 1 mL% 5 dekstroz uygulayın (i.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne).
NOT: 1 mL %5 dekstroz enjeksiyonu, hayatta kalma oranını artırabilecek enerji kaynağı ve hidrasyon sağlar.
- Kuvözde bakım sonrası (28–30 °C) tükürük, gözyaşı ve dışkı gibi aşırı salgıları silin.
- SE indüksiyonundan sonraki 1. günde, fareleri tartın ve bir gün daha inkübatörde (28-30 ° C) tutun. 2. günde, SE indüksiyonundan sonra, fareleri tartın ve onları ev kafeslerine geri koyun. İyileşmelerini kolaylaştırmak için nemli yemek sağlayın.
NOT: Bu deneyde, SE sonlandırıldıktan sonra C57BL / 6NHsd için mortalite oranı ortalama% 8.57 idi (test edilen 35 fareden 3'ü).
- Pilokarpinden 7 gün sonrasına kadar hayvanların günlük vücut ağırlığını ölçün ve vücut ağırlığı artmadığında farelere% 5 dekstroz (i.p.; 1 mL şırınga; 26 G iğne) enjekte edin. Pilokarpin enjeksiyonundan 2 gün sonra fareler vücut ağırlığını geri kazanmaya başladığında vücut ağırlığı izlemeyi bırakın ve zorluk çekmeden nemli yem tüketin.
NOT: Bir farenin vücut ağırlığı SE'den 7 gün sonrasına kadar artmadıysa, fareyi deneyden çıkarın ve karbondioksit ile ötenazi yapın. Farenin arka planına bağlı olarak, zaman zaman ölüm meydana gelebilir; bununla birlikte, C57BL / 6NHsd durumunda, bu deneylerde farelerin% 1'inden azı öldü. SE indüksiyonundan sonra 7 günden fazla hayatta kalma ile, fareler latent dönemde nadiren ölürler.
