Tümörlerden Organoidlerin Hazırlanması: 3 Boyutlu İn Vitro Tümör Modeli

Burada açıklanan hayvan prosedürleri, Buffalo, New York, Roswell Park Kapsamlı Kanser Merkezi, Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Departmanı'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçekleştirilmiştir.

NOT: Organoid oluşumu için prostatları veya prostat tümörlerini izole etmek için diseke edilecek erkek fareler, en azından cinsel olgunluk yaşına ulaşmış olmalıdır - yaklaşık 8-10 haftalık. Farelerin belirli yaşları çalışmalar arasında değişebilir. Yaş seçerken göz önünde bulundurulması gereken bazı faktörler arasında prostat hücresi popülasyonlarındaki yaşa bağlı değişiklikler, spesifik promotör güdümlü Cre transgenlerinin yaşa bağlı ekspresyonu ve belirli bir GEMM'de prostat tümörü ilerlemesinin hızı yer alır.

NOT: Şekil 1, tümör organoidlerinin oluşturulması prosedürünün resimli bir açıklamasını göstermektedir.

1. Hazırlık

1. Fare prostat organoid ortamını Drost ve ark.'ya göre hazırlayın. aşağıdaki değişikliklerle. Noggin ve R-Spondin için rekombinant proteinler yerine şartlandırılmış ortam kullanın ve hem Noggin hem de R-Spondin şartlandırılmış ortam için %10 yerine %1 (h/v) nihai konsantrasyon kullanın.
   NOT: HA-fare Noggin-Fc veya HA-fare Rspo1-Fc ile stabil bir şekilde transfekte edilen HEK293 hücreleri, sırasıyla Noggin veya R-Spondin koşullu ortam üretmek için kullanılır. Bu hücre hatları, Stanford Üniversitesi'ndeki Calvin Kuo Laboratuvarı'ndan bir hediyeydi.
2. 20 mg / mL kollajenaz II'yi Gelişmiş DMEM / F12 (+++) ortamı ile 5 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek 15 mL'lik bir tüpte sindirim çözeltisi hazırlayın. Y-27632 Kaya İnhibitörü, 10 μM.
   'lik bir nihai konsantrasyonda kollajenaz II çözeltisine ekleyin NOT: Sindirim tamponunun dokuya oranı 1 mL ila 50 mg'dır, bu da Drost ve arkadaşlarına göre kullanıyoruz.

2. Tümör Dokusunun Kıyılması ve Sindirimi

1. Hücre kültürü başlığında, prostat tümör dokusunu 10 cm'lik steril bir kültür kabına yerleştirin, nekrotik dokuyu inceleyin ve atın.
2. Kalan prostat tümör dokusunu steril kavisli forseps ile doku parçalarından tutarak ve diseksiyon makası ile keserek 1 mm³ küp şeklinde kıyın.
3. Kıyılmış tümör parçalarını, forsepsin kavisli tarafı ile kepçe ile sindirim tamponu ile 15 mL'lik tüpe yerleştirin. Tümör dokusunu 37 ° C'de 1,5 ila 2 saat çalkalayarak sindirin. Her 20 dakikada bir sindirim ilerlemesini kontrol edin
   NOT: Bu sırada, -20 ° C'lik depolamadan en az 2 mL matris çıkarın ve buz üzerinde çözdürün. 1 mL matris alikotlarının çözülmesi yaklaşık 3 saat sürecektir.
4. Doku sindiriminden sonra, bir hücre peleti oluşturmak için tüpü 175 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı çıkarın, hücre peletini gevşetmek için tüpü hafifçe vurun ve hücre peletini 10 μM Y-27632 Kaya İnhibitörü ile desteklenmiş 1 mL önceden ısıtılmış tripsin içinde yeniden süspanse edin. Tüpü 5 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
6. İnkübasyondan sonra, standart bir P1000 ucu ile 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpü 5 dakika daha 37 °C su banyosuna getirin ve 2.6.
   adımını tekrarlayın NOT: Prosedürün bu sırasında, steril bir 6 oyuklu hücre kültürü kabını 55 ° C'lik bir inkübatöre koyarak ısıtın.

3. Matriste Hücre Sayma ve Yeniden Süspansiyon

1. 9 mL soğuk AdDMEM/F12(+++) ekleyerek hücreleri yıkayın ve tüpü 175 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
2. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, peleti gevşetmek için tüpü hafifçe vurun ve 10 mL soğuk AdDMEM / F12 (+++) ekleyerek hücreleri tekrar yıkayın. Tüpü 175 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
3. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, peleti gevşetmek için tüpü hafifçe vurun, hücreleri 1 mL AdDMEM / F12 (+++) içinde yeniden süspanse edin ve standart prosedüre göre bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
4. Yedi ila sekiz kubbe, organoidler matris içinde damla damla bir şekilde kaplandığında 6 oyuklu bir çanağın bir kuyusuna sığar. Yaklaşık 200 μL matris 7-8 kubbe üretecektir. Gelecekteki deneysel amaçlar için kaç tane organoid kuyusuna ihtiyaç duyulduğuna karar verin ve gereken matris hacmini hesaplayın. Ardından, 1.0 x 10⁶ hücre / mL matris nihai konsantrasyonuna sahip olmak için gereken hücre içeren çözeltinin hacmini hesaplayın.
5. Hücreleri saydıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 175 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, peleti gevşetmek için tüpü hafifçe vurun ve hücreleri adım 3.4.
   'de hesaplanan matris hacminde yeniden süspanse edin NOT: Matris sadece 4 °C'de sıvı halde kalır; Matris stok tüplerini ve matris hücre çözeltilerini her zaman buz üzerinde tutun.

4. Matris Kubbelerin Kaplanması ve Ortamın Uygulanması

1. Hücreleri kabarcıklar oluşturmadan eşit şekilde dağıtmak için matris hücre çözeltisini bir P200 pipeti ile karıştırın. 6 oyuklu kültür kabını 55 °C inkübatörden çıkarın.
2. 200 μL matris hücre çözeltisini dikkatlice pipetleyin ve kubbeler oluşturmak için çözeltiyi hızla bir kuyuya bırakın.
3. Matris hücre çözeltisinin hacmi tükenene kadar adım 4.2'yi tekrarlayın. Kubbelerin oda sıcaklığında 2 dakika katılaşmasına izin verin.
4. 6 oyuklu tabağı ters çevirin ve 20 dakika boyunca katılaşmaya devam etmek için tabağı 37 °C'lik bir inkübatöre koyun.
5. İnkübasyondan sonra, her oyuğa 2 mL fare prostat organoid ortamı ekleyin. 1 nM'lik bir nihai konsantrasyon için her bir oyuğa sentetik androjen R1881 ve 10 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar Y-27632 Kaya İnhibitörü ekleyin. Dikkatlice karıştırın ve plakayı kültürleme için 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
   NOT: Organoid kültür ortamının, organoid oluşumundan sonra sadece 1 hafta boyunca 10 μM Y-27632 Kaya İnhibitörü ile desteklenmesi gerekir.

Şekil 1: Prostat tümörü organoidleri oluşturmak için protokolün akış şeması. Prostat tümörünü diseksiyon ettikten sonra dokuyu 1 mm'lik parçalar halinde kıyın. Tümör parçalarını kollajenaz içinde sindirin, hücreleri toplayın ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tripsin içinde sindirin. Hücreleri saydıktan sonra, 1.0 x 106 hücre / mL hücre konsantrasyonu için gereken matris hacmini yeniden askıya alın. Tabak kubbeleri damla damla bir yöntem kullanarak tabakta. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.