Yumurtalık Kanserinin İşlevselleştirilmiş Nanopartikül Hedeflemesi: Over Kanseri Hücreleri Tarafından Folik Asit Konjuge Nanopartikül Kontrast Madde Alımını Kolaylaştıracak Bir Teknik

Özet

Kaynak: Lusk, J. F. et al. Fotoakustik Akış Sitometrisi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Tespiti. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, folik asit başlıklı bakır sülfür nanopartiküllerinin (CuS NP'ler) içselleştirilmesini kolaylaştıracak bir teknik gösteriyoruz. Folik asit ile işlevselleştirilmiş CuS NP'ler, birçok yumurtalık kanseri hücresinde aşırı eksprese edilen folat reseptörlerini hedefleme yeteneğine sahiptir.

Protokol

1. Nanopartikül Sentezi ve İşlevselleştirme

DİKKAT: Tüm sentez, havalandırılan bir kimyasal çeker ocakta yapılmalıdır.

1. Sentezden önce, yaklaşık 300 mL deiyonize (DI) suyu 0,2 μm steril bir filtreden süzün.
2. 250 mL'lik cam yuvarlak tabanlı bir şişeyi deterjan solüsyonuyla temizleyin ve DI su ile durulayın. 1 mM'lik bir çözelti oluşturmak için 100 mL DI suya 0.0134 g CuCl₂ ekleyin.
3. CuCl₂ çözeltisine 0.015 g folik asit (FA) ekleyin ve manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak ~ 5 dakika karıştırın.
4. 200 μL'lik bir pipet kullanarak reaksiyon karışımına yaklaşık 10 saniye boyunca Na₂S·9H₂O (100 μL DI suda 0,024 g) ekleyin.
   not: Na₂S·9H₂O'nun eklenmesi üzerine, çözeltinin rengi açık sarıdan koyu kahverengiye değişecektir.
5. Reaksiyonu kapatın ve 90 °C'ye ayarlanmış bir yağ banyosuna koyun ve manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırmaya devam edin. Yaklaşık 15 dakika sonra veya yağ banyosu 85−90 °C'ye ulaştığında, reaksiyonun bir saat daha devam etmesine izin verin. Karışımınız yavaş yavaş koyu yeşil bir renge dönmelidir.
   not: Basınç oluşumunu önlemek için reaksiyon karışımını ısıtırken sistemi havalandırdığınızdan emin olun.
6. Reaksiyon kabını yağ banyosundan çıkarın ve bir buz banyosuna aktarmadan önce oda sıcaklığında yaklaşık 10 ila 15 dakika kısa bir süre soğutun.
7. Reaksiyon karışımı 20 °C'nin altına soğuduktan sonra, kalan folik asidi çözelti halinde çözmek için 1M NaOH kullanarak pH'ı 10'a ayarlayın.
8. FA-CuS reaksiyon karışımını 30 kDa'lık bir santrifüj sütunu kullanarak saflaştırın. Çözeltiyi kolona 15 mL'lik gruplar halinde ekleyin ve 15 dakika boyunca 3.082 x g'da santrifüjleyin.
9. Reaksiyon karışımının tamamı konsantre edildikten sonra, konsantre fraksiyonları yeniden birleştirin ve 30 kDa santrifüjleme kolonunda 4x'i 15 mL pH 10 NaOH ile yıkayın.
10. Kütle ölçümleri için, çözeltinin 1 / 3'ünü (~ 66 μL) alın ve üç cam şişeye bölün. Vakumlu fırında gece boyunca 40 °C'de ~27 mmHg vakum altında kurutun.
11. Konsantre çözeltinin diğer 2 / 3'ünü 250 μL PBS'ye çözün ve daha fazla kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
12. FA-CuS NP'leri kullanmadan önce, yüksek ayarda bir banyo sonikatöründe 30 dakika boyunca sonikasyon yapın.

2. FA-CuS NP'lerin Yumurtalık Kanseri Hücreleri Tarafından Alınması

1. FA-CuS NP'lerle inkübasyondan önce, SKOV-3 hücrelerini en az 24 saat boyunca% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren 8-15 mL folik asit içermeyen RPMI-1640 ortamı ile bir T75 şişesinde inkübe edin.
2. Hücreleri, 0.1 x 10⁶ hücre / mL yoğunlukta 0.5 mL folik asit içermeyen RPMI-1640 tam büyüme ortamında 24 oyuklu bir plakaya tohumlayın.
3. Ertesi gün, hücreleri 400 μg / mL FA-CuS NPS ile 0.5 mL folik asit içermeyen RPMI-1640 tam büyüme ortamında 2 saat inkübe edin.
4. Bu inkübasyonu takiben, hücreleri EDTA ile 0.5 mL% 0.25 tripsin ile tripsinize edin. Tripsini nötralize etmek için en az 1 mL folik asit içermeyen RPMI-1640 tam büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri 6 dakika boyunca 123 x g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatanı çıkarın, hücreleri 2 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve 6 dakika boyunca 123 x g'da santrifüjleyin. Bağlanmamış NP'leri çıkarmak için bu yıkama adımını 2x gerçekleştirin.
6. Hücreleri% 2 Tween çözeltisi ile 1-2 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
7. Bir hemositometre ve Tripan Mavisi kullanarak hücreleri sayın. Ayrıca, hücre sayıları çok yüksekse hücreleri seyreltin. PBS'deki hücreleri, tespit için seçilen konsantrasyona kadar% 2 Tween ile seyreltin.
8. Hücreler artık PAFC sistemi tarafından analiz edilmeye hazırdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
EDTA ile% 0.025 tripsin	Corning	25-053-CL
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtreler	Kırlangıç	UFC903024
Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtreler	Kırlangıç	UFC803024
Parlak Çizgili Hematositometre	Hausser Bilimsel	1492
Bakır(II) Klorür	ACROS ORGANİK	206532500
CPX Serisi Dijital Ultrasonik Temizleme Banyosu	Balıkçı markası	Model CPX3800
Norm-Ject 10 mL Şırınga	HENKE KURT	4100-X00V0
FBS (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
Folik Asit	Sigma-Aldrich	F7876-10G
Pbs	Alfa Aesar	J62036
Penisilin Streptomisin	GIBCO Bilişim Teknolojileri	15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) Folik Asit İçermez	Gibco (Gibco)	27016-021
SKOV-3 Hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-77
Sodyum Hidroksit Boncuklar	BDH (Türkçe)	BDH9292-500G
Sodyum Sülfür Nonahidrat	Sigma-Aldrich	431648-50G
Tripan Mavisi Çözeltisi %0.4	Amresco Belediyesi	K940-100ML
0,2 μm steril şırınga filtresi	VWR (VWR)	28145-477
Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1.8KG	Cam eşyaların temizliğinde kullanılan deterjan.
Ara 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML

Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Radarı Gazetesi Serisi Belediyesi Gazetesi Gazetesi Serisi