$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İnsan yumurtalık kanseri dokularından mitokondri hazırlanması
Bu protokol için
Over kanseri dokularını (n=7) içeren over doku örnekleri kullanıldı.
- 210 mM mannitol, 70 mM sükroz, 100 mM potasyum klorür (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamin tetraasetik asit (EDTA), 0.1 mM etilen glikol bis (2-aminoetil eter) tetraasetik asit (EGTA), 1 mM fenilmetansülfonil florür (PMSF) proteaz inhibitörü, 2 mM sodyum ortovanadat (V) ve% 0.2 sığır serum albümini (BSA), pH 7.4'tür.
- ~ 1.5 g yumurtalık kanseri dokusunu temiz bir cam kaba koyun.
- Kanı doku yüzeyinden 3 kez hafifçe yıkamak için önceden soğutulmuş 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin.
- Dokuyu yaklaşık 1 mm3 parçaya tamamen kıymak için temiz oftalmik makas kullanın ve kıyılmış dokuları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 0,2 mg / mL nagarse içeren 13,5 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve ardından kıyılmış dokuları (2 dk, 4 ° C) homojenize etmek için bir elektrikli homojenizatör kullanın (ölçek 2, 10 s 6x, aralık 10 s kullanın).
- Doku homojenatlarına 3 mL daha mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.
- Hazırlanan doku homojenatını santrifüjleyin (1.300 x g, 10 dk, 4 °C). Ham nükleer fraksiyonu (yani peleti) çıkarın ve süpernatanı koruyun.
- Süpernatanı yeniden santrifüjleyin (10.000 x g, 10 dk, 4 °C). Mikrozomları (yani süpernatanı) çıkarın ve peleti saklayın.
- 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin ve hafif pipetleme ile pelet kuyusunu yeniden süspanse edin.
- Pelet süspansiyonunu santrifüjleyin (7.000 x g, 10 dk, 4 °C). Süpernatanı atın ve ham mitokondriyi (yani peleti) saklayın.
- Ekstrakte edilen ham mitokondriyi yeniden süspanse etmek için 12 mL %25 yoğunluk gradyan ortamı (yani Nycodenz) ekleyin.
- Bir tüpü aşağıdan yukarıya doğru 5 mL %34, 8 mL %30, 12 mL %25 (adım 1.11'den ham mitokondri içeren), 8 mL %23 ve 3 mL %20 yoğunluk gradyan ortamı ile doldurarak süreksiz bir yoğunluk gradyanı yapın ve santrifüjleyin (52.000 x g, 90 dk, 4 °C).
- Saflaştırılmış mitokondriyi %25 ve %30 yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arayüzde temiz bir tüpe toplamak için uzun ve kör bir şırınga kullanın.
- Üç kat hacme seyreltmek için toplanan mitokondriye mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin. Santrifüjleyin (15.000 x g, 20 dk, 4 °C) ve süpernatanı atın.
- Pelet ve santrifüjü yeniden süspanse etmek için 2 mL mitokondriyal izolasyon tamponu ekleyin (15.000 x g, 20 dk, 4 °C). Süpernatanı atın ve peleti saklayın.
- Son peleti (yani saflaştırılmış mitokondriyi) toplayın ve -20 °C.
'de saklayın
not: Yumurtalık kanseri dokusundan saflaştırılmış tüm mitokondriyi kantitatif proteomik analiz için mitokondri örneği olarak birleştirin.