Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. In vitro VX2 hücre hattının oluşturulması
- VX2 tümörünü tavşan kuadriseps kasından ve fare kanadındaki büyümeden hasat edin.
- Donmuş VX2 tümör bloklarını (1 cm x 1 cm) çözün, bir neşter bıçağı kullanarak bir kültür plakasında kıyın ve tüm hücrelerin 1 mL'lik son hacim için süzülmesini sağlamak için sırayla az miktarda Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ekleyerek 70 μm'lik bir filtreden süzün.
- Hücreleri sayın ve% 0.9 fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi ile 1 x 107 / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin ve steril bir tüpte buzun üzerine yerleştirin.
not: Tümör blokları, tavşan kuadriseps kaslarında VX2 tümörlerinin önceki yayılımından bir laboratuvar işbirlikçisinden elde edildi.
- Dişi beyaz bir Yeni Zelanda tavşanını (ağırlık 2.5-3.5 kg)% 2-5 inhale izofluran ile uyuşturun, enjeksiyon bölgesinin üzerindeki kürkü çıkarın ve enjeksiyon bölgesini povidon-iyot çözeltisi ile temizleyin. Hazırlanan VX2 hücre süspansiyonunun 500 μL'sini (5 x 106 hücre / mL) tavşanın kuadriseps kasına enjekte edin. 10. günden itibaren tavşanı tümör büyümesi açısından klinik olarak izleyin.
- Tümörler 1-1,5 cm çapa ulaştıktan sonra (kaliperlerle dışarıdan ölçülür) veteriner onaylı bir yöntem kullanarak tavşanları ötenazi yapın. Kalp atış hızı ve solunum hızı dahil olmak üzere hayati belirtileri kontrol ederek ötenaziyi onaylayın. Alanı betadin solüsyonu ile temizledikten sonra steril aletler kullanarak tümörü çıkarın.
- Steril aletler kullanan bir biyolojik güvenlik kabininde, bir neşter bıçağı kullanarak tümörü 10 cm'lik bir doku kültürü kabı üzerinde küçük parçalar halinde (0,2 cm) doğrayın. Tümör fragmanlarını, adım 1.1.1'de tarif edildiği gibi 1 mL HBSS kullanarak 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri sayın ve 200 μL'de 7.5 x 105 hücre elde etmek için% 0.9 tuzlu su çözeltisi kullanarak seyreltin.
- Erkek NOD SCID gama farelerini (ağırlık 25 g) 1 L / dk'da% 4 izofluran kullanarak uyuşturun ve% 2 izofluran kullanarak anesteziyi koruyun. Fareler uyuşturulduktan sonra, 27 gauge iğne kullanarak fare kanadının deri altı dokusuna adım 1.1.5'ten 200 μL solüsyon enjekte edin.
- VX2 hücrelerinin in vitro olarak toplanması ve pasajlanması
- Kaliperler kullanarak tümörlerin çapı 1 cm'ye ulaşana kadar ksenogreft büyümesini haftada iki kez klinik olarak izleyin.
- Fareleri bir CO2 odasına yerleştirerek veya% 4 izofluran gazı ile anestezi yaptıktan sonra servikal çıkık yaparak ötenazi yapın. Tümörleri steril koşullar altında biyolojik güvenlik kabininde çıkarın.
- Tümörleri 3 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham'ss F12+ %10 fetal sığır serumu (FBS) ortamı içeren 6 cm'lik bir doku kültürü kabında neşter ile 1-2 mm'lik parçalar halinde doğrayın.
- Tümör parçalarını, hücreler tümör parçalarından çıkmaya başlayana kadar iki gün boyunca% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde rahatsız edilmeden bırakın. Daha sonra, hücre birleşmesi için kültür plakalarını günlük olarak ışık mikroskobu ile kontrol edin. % 70 birleşmeye ulaştıktan sonra, şişeye 1 mL% 0.05 tripsin ekleyerek ve 5 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre geri koyarak hücreleri tripsinize edin.
- Tripsini 6 mL DMEM / Ham'ss F12 +% 10 FBS ortamı ile nötralize edin, hücreleri toplayın ve 4 ° C'de 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 3,5 mL yeni DMEM/Ham'ss F12 + %10 FBS ortamında yeniden süspanse edin. Yaklaşık% 50 hücre tohumlama yoğunluğu elde etmek için plaka başına 1.6 x 106 hücreli taze 6 cm kollajen I kaplı plakalar.
NOT: %50 hücre yoğunluğu, takıldığında plakanın yüzey alanının %50'sini kaplayan hücreleri ifade eder.
- Erken geçiş: Hücreler 5 kez geçilene kadar yukarıdaki işlemi (tripsinleme, tohumlama) tekrarlayın ve ardından tavşan genomik DNA'sını fare genomik DNA'sından ayırt etmek için kantitatif bir PCR testi kullanarak PCR ile hücre hattı saflığını değerlendirin (bkz. adım 1.3.1-1.3.4).
not: 8 geçişten sonra, hücreler kollajen kaplı olmayan düzenli yapışkan doku kültürü plakaları üzerinde çoğaltılabilir.
- DMEM / HAM F12 +% 30 FBS +% 10 DMSO'daki hücrelerin alikotlarını flakon başına 2 x 106 konsantrasyonda geçiş, tripsinize edin ve dondurun. Deneyler için gerekli olana kadar hücreleri sıvı nitrojen içinde saklayın.
- Hayatta kalan hücrelerin VX2 kökeninin doğrulanması:
- Saflaştırılmış genomik fare ve tavşan DNA'sından standart bir tedavi oluşturun (Adım 1.3.2 ve Adım 1.3.3). LINE-1 retrotranspozon elemanının ikinci açık okuma çerçevesi içinde türe özgü dizileri hedefleyen primerler kullanın.
not: CRPV E6 için primer dizileri şunlardır: 5'ler- GATCCTGGACCCAACCAGTG ve 5'ler-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. LINE-1 retrotranspozon elemanları kullanıldı. Tavşan LINE-1 için primer dizileri şunlardır: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC ve 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Fare LINE-1 için primer dizileri: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG ve 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
- CRPV E6 için standart bir eğri oluşturmak için, üreticinin protokolünü takip eden ticari bir kit kullanarak VX2 tümör hücresi lizatını (Adım 1.1.1) saflaştırın. Bu DNA'yı ticari bir tahlil kullanarak ölçün. Düşük EDTA-TE tamponunda 225 pg / μL ila 0.925 pg / μL arasında 6 seri seyreltme gerçekleştirin. Fare genomik DNA'sı için standart bir eğri oluşturmak için, 100 μg ticari fare genomik DNA'sını düşük EDTA-TE tamponunda 125 pg / μL'den 0.0125 pg / μL'ye kadar 5 seyreltmede seyreltin.
- Adım 1.3.2'deki numunelerden her seyreltilmiş çözeltiden 4 μL'yi kuyucuklara yerleştirin ve numuneleri bir PCR termocycler'da çalıştırın. Termocycler yazılımı otomatik eşik ayarlarını kullanarak standart bir eğri hesaplamak için oyuk başına DNA miktarlarıyla birlikte her çalıştırmadan elde edilen Cq değerlerini kullanın.
- Bir termocycler üzerinde 40 döngü 2 adımlı döngü (98 °C ve 60 °C) ile PCR gerçekleştirmek için standart qPCR prosedürlerini kullanın. Tavşan VX2 hücre hattında minimum fare kontaminasyonu olduğundan emin olmak için eşik değerleri belirleyin ve delta Ct değerlerini >35'e ayarlayın. Her reaksiyonun toplam hacmi 10 μL idi, 5 μL 2x Mastermix, 1 μL ileri + geri primerler ve 250 nM'de reaksiyonda son primer konsantrasyonu ve 4 μL DNA örneğinden oluşuyordu.
not: Eşik değerler belirlenir ve tavşan VX2 hücre hattında minimum fare kontaminasyonu olmasını sağlamak için delta Ct değerleri >35'e ayarlanır. qPCR ile güvenilir tespit için önerilen VX2 DNA seviyesi 1-10 pg'dir.
2. VX2 hücre kültürü ve hücre süspansiyonunun oluşturulması
- VX2 hücreleri içeren şişeleri (adım 1.2.7'de dondurulmuş) 37 ° C'de 1 dakika boyunca bir su banyosunda çözün ve hücreleri 10 mL kültür ortamı (1: 1 DMEM / F-12 +% 10 FBS ve% 1 Penisilin-streptomisin) içeren konik bir santrifüj tüpüne aktarın. 107 x g'da 8 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini 9 mL ortamda yeniden süspanse edin.
- Yeniden süspanse edilmiş hücreleri büyük bir kültür şişesine aktarın. Hücreleri 37 ° C'de sallamadan inkübe edin. Işık mikroskobu kullanarak hücreleri günlük olarak birleşme açısından kontrol edin ve kültür ortamını her üç günde bir değiştirin.
- Enjeksiyon için kültürlenmiş VX2 hücre süspansiyonunun oluşturulması
- Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında şişeye 3 mL %0.25 tripsin ekleyerek hücreleri tripnize edin. Şişeyi 5 dakika boyunca inkübatöre (37 °C) koyun. Çözeltiyi konik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 107 x g'da 8 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın.
- Hücre peletlerini 9 mL fosfat tamponlu tuzlu su ile 3 kez yıkayın, santrifüjleyin ve süpernatanı yukarıdaki gibi çıkarın. Hücreleri sayın ve% 0.9 fosfat tamponlu salin çözeltisi ile 4 x 107 hücre / mL konsantrasyona seyreltin ve buz üzerinde steril bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Enjeksiyon için in vivo çoğaltılmış VX2 hücre süspansiyonunun oluşturulması
- Donmuş VX2 tümör bloklarını (1 cm x 1 cm) çözdürün, bir neşter bıçağı kullanarak bir kültür plakasında kıyın ve adım 1.1.1'deki gibi 70 μm'lik bir filtreden süzün. Tüm hücrelerin 1 mL'lik bir son hacim için süzüldüğünden emin olmak için sırayla küçük miktarlarda HBSS ekleyin. Hücreleri sayın ve% 0.9 fosfat tamponlu salin ile 1 x107 / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin ve steril bir tüpte buzun üzerine yerleştirin.
not: Tümör blokları, tavşan kuadriseps kaslarında VX2 tümörlerinin önceki yayılımından bir laboratuvar işbirlikçisinden elde edildi.
>3. Cerrahi Model Kurulumu
- Cerrahi anestezinin oluşturulması ve ameliyat öncesi hazırlık
- Planlanan cerrahi prosedürden 1 saat önce asepromazin (1 mg / kg IM) ve meloksikam (0.2 mg / kg SQ) enjeksiyonları kullanılarak dişi beyaz Yeni Zelanda tavşanlarını (2.5-3.5 kg) tedavi edin. Dişi beyaz bir Yeni Zelanda tavşanını (ağırlık 2.5-3.5 kg)% 2-5 inhale izofluran ile uyuşturun, enjeksiyon bölgesinin üzerindeki kürkü çıkarın ve enjeksiyon bölgesini povidon-iyot çözeltisi ile temizleyin.
- Anestezi uygulanmış tavşanları bir laringeal maske hava yolu (LMA) kullanarak entübe edin ve bantla yerine sabitleyin, solunan izofluran dozunu% 2-5 arasında titre ederek derin anesteziyi koruyun. Hayati belirtileri (solunum hızı, kılcal damar dolumu, varsa oksijen satürasyonu) kontrol ederek ve ağrıyı (hareket, uyaranlardan çekilme, sesler) veya hafif anesteziyi (hareket, LMA tüpünde çiğneme) düşündüren belirtileri izleyerek prosedür boyunca cerrahi anesteziyi düzenli olarak izleyin.
not: Bu, cerrahi anesteziyi izleme deneyimi olan biri tarafından yapılmalıdır.
- Marjinal dorsal ven içine 22 gauge kulak damarı kateteri yerleştirin. Cerrahi cilt insizyonundan 10 dakika önce intravenöz olarak sefazolin (20 mg / kg) uygulayın.
- Tavşanı ameliyat masasına yerleştirmeden önce pelvis ve karın üzerine kıl tokatlayın, ardından tavşanları ameliyat masasına sırt pozisyonunda yerleştirin. 3 aşamalı bir cerrahi cilt hazırlığı (betadin sabunu, klorheksidin solüsyonu, betadin solüsyonu) kullanarak cerrahi alanı temizleyin. Kasık kemiğinin üst kısmını işaretledikten sonra cerrahi alanı laparotomi örtüleri ile örtün ve alt karnın 5 cm x 5 cm'lik bir alanını açıkta bırakın.
- Laparotomi insizyonunun oluşturulması ve uterus boynuzlarının tanımlanması
- Cerrahi bir başlık ve yüz maskesi takın. Klorheksidin veya betadin cerrahi ovma solüsyonu kullanarak ellerinizi ovalayın. Steril teknik kullanarak, steril bir önlük ve steril cerrahi eldiven giyin.
- # 11 bıçaklı bir neşter kullanarak, tavşan karnının derisi ve deri altı dokusu yoluyla simfiz pubisine 1 cm kraniyal 2,5 cm uzunluğunda bir kesi yapın. Rektus fasyasını kesin ve altta yatan peritonu ortaya çıkarmak için rektus kaslarını yanal olarak inceleyin. Alt yüzeyin bağırsak veya diğer karın organlarından arındırıldığından emin olduktan sonra peritona keskin bir şekilde girin.
- İdrar kesesini tanımlayan ve eldivenli bir parmağı mesanenin tepesi üzerinde üstün, arka ve yan olarak süpüren uterus boynuzlarını bulun.
not: Gerekirse, dijital basınç kullanılarak dolu mesane boşaltılabilir. Yerleştirildikten sonra, karın duvarına dayanmak için uterus boynuzlarını karın kesisinden geçirin.
- 3-0 örgülü emilebilir sütür kullanarak, servisarların yaklaşık 1.5-2.0 cm distalinde her bir uterus boynuzuna tek bir dikiş ligasyonu gerçekleştirin. Sütürü, her bir boynuzun lateral yönü boyunca uzanan uterus arterlerinin hemen ortasına yerleştirin. Distal uterin boynuzları tıkamak için dikişleri sıkıca bağlayın (Şekil 1).
- Miyometrial VX2 aşılaması
- 27 gauge bir iğne kullanarak, önceden hazırlanmış VX2 hücre süspansiyonunun 0.5 mL'sini, 2.3.2 (kültürlenmiş VX2 modeli için) veya 2.4'ten (in vivo çoğaltılmış VX2 modeli için) her uterus boynuzunun miyometriyumuna enjekte edin. 1 dakikadan fazla enjekte edin ve hücrelerin alttaki rahim boşluğuna enjekte edilmediğinden emin olun. Solunan izofluran (% 2-5) ve Bain devresine sahip bir anestezik makine kullanarak hayvanları uyuşturun.
- Hücre sızıntısını en aza indirmek için enjeksiyondan sonra miyometriyal enjeksiyon bölgesine 30 saniye boyunca basınç uygulayın. Enjeksiyon ve dikiş bölgelerini hemostaz açısından inceleyin ve uterus boynuzlarını tekrar karın içine yerleştirin.
- Ameliyat kesisinin kapatılması
- Derin karın duvarı kapanması: Periton insizyonunun tepesini belirleyin ve periton, rektus kası ve fasyayı doku forsepsleri ile kavrayın.
- Bunu yapmak için, insizyonun bir tarafında yüzeysel derine ve diğer tarafında derinden yüzeysel dikerek dikişi insizyonun bir ucuna sabitleyin. Bir düğüm at. Ekteki dikişi kullanarak, insizyon boyunca bir yandan diğer yana adım adım ilerleyerek karın duvarının katmanları boyunca insizyona dik dikişler yapın. Sütürü bağlayın ve kesin.
- Yüzeysel karın duvarı kapatması: Cilt kesisinin tepe noktasını belirleyin ve gömülü çalışan subkutiküler 3-0 emilebilir poli-filament sütür kullanarak karın derisini dikin. Cilt kenarlarına karşı koymak için kapalı kesiye cerrahi yapıştırıcı sürün.
- Bunu yapmak için, insizyonun bir tarafında derinden yüzeysele, diğer tarafında yüzeyselden derine dikerek dikişi insizyonun bir noktasına sabitleyin. Bir düğüm at. Ekteki dikişleri kullanarak, kesi boyunca bir yandan diğer yana adım adım çalışarak kesiye paralel olarak dermal tabakada akan dikişler yapın. Sütürü bağlayın ve kesin.
- Ameliyat sonrası bakım
- Anesteziden uyandırma: Kesi kapandıktan sonra izofluranı kapatın ve uyanma belirtilerini izlerken tavşanın maske ile oksijen solumasına izin verin (ör., spontan hareketler, göz açma ve laringeal maske hava yolundaki çiğneme hareketleri). Bu belirtiler not edildikten sonra tavşanı ekstübe edin ve tavşanlar uyanık olana ve bağımsız olarak oturabilene kadar maske ve ılık bir battaniye ile oksijen sağlayın.
- Ameliyat sonrası izleme: Tavşanları 4 gün boyunca günde iki kez ve ameliyat sonrası 10 gün daha günde izleyin. Genel durumlarını, yiyecek ve su alımlarını, idrar ve dışkı çıkışını, ağrı değerlendirmesini, kilolarını, yaşamsal belirtilerini (kalp atış hızı, solunum hızı) ve şişlik, eritem, akıntı veya ayrışma arayan cerrahi bölgelerini izlemek, değerlendirmek.
- Ameliyat sonrası ağrı kontrolü: Ameliyat sonrası 48 saat boyunca her gün (0.2 mg / kg SQ) Meloksikam uygulayın ve daha sonra ağrı değerlendirmesine göre gerektiği gibi uygulayın. Buprenorfini ameliyattan hemen sonra ve 24 saat boyunca her 12 saatte bir (0.01-0.05 mg / kg SQ) uygulayın ve daha sonra ağrı değerlendirmesine göre gerektiği gibi uygulayın
- Veteriner hekiminizin önerdiği şekilde yara enfeksiyonunu önlemek için antibiyotikler (enrofloksasin 5 mg / kg IM) ameliyat sonrası yedi gün boyunca günlük olarak uygulanabilir. Dehidrasyon için gerektiği kadar deri altı sıvıları (15 mL SQ) günde iki kez uygulayın ve kilo kaybı için gerektiğinde günlük olarak yumuşak gıdalar veya diğer diyet takviyeleri sağlanır.
