Görüntüleme Kütle Spektrometresi Analizi için Over Kanseri İletişiminin Modellenmesi: Metastatik Over Tümörü Gelişiminde Küçük Moleküllü Kimyasal İletişimcileri Tanımlamak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Zink, K. E. et. al. Görüntüleme Kütle Spektrometresi Kullanarak Dokular ve Hücreler Arasındaki Küçük Molekül İletişimini Yakalama. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu protokol, yumurtalık eksplantlarını fallop tüpü kanseri hücreleriyle birlikte kültürleyerek numune hazırlama tekniğini açıklar. Bu örnekler, tümör gelişimine yol açan hücreler ve dokular arasındaki küçük molekül değişimini tespit etmek için görüntüleme kütle spektroskopisi veya IMS kullanılarak görselleştirilir.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. Kokültürler için ITO Destekli Slaytın Ayarlanması ve İnkübe Edilmesi

1. Bölünmemiş kokültürler
   1. Agarozu sıcak bir plaka üzerinde 70 °C'de sıvılaştırın.
   2. 8 oyuklu bölücüyü indiyum tinoksit (ITO) ile muamele edilmiş sürgünün üzerine yerleştirin (Şekil 1A). Bölücü üzerindeki kauçuk taban, sürgüye yapışmaya yardımcı olur, ancak oyuklar arasında sızıntı veya karışım olmamasını sağlamak için agaroz kaplama sırasında sürekli olarak hafif aşağı doğru basınç uyguladığınızdan emin olun.
   3. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın, santrifüjleyin (800 rpm'de 5 dakika) ve 1x DMEM ortamında 150 μL'de 50 bin hücreye yeniden süspanse edin. Farklı bir hücre yoğunluğu optimal ise, bu adımda hücre süspansiyonunun istenen nihai yoğunluğun 2 katı olduğundan emin olun (örneğin, 300 μL'de 50.000 hücrelik bir nihai konsantrasyon için, bu adımdaki hücre yoğunluğu 150 μL'de 50.000 hücredir).
   4. Hücre kültürünü kaplamadan önce, kuyucuğun ortasına yumurtalık eksplantını ekleyin (Şekil 1B).
   5. Kaplamadan hemen önce her hücre kültürüne ayrı ayrı 2 mL'lik tüplerde agaroz ekleyin. Her kuyucuk için, 2 mL'lik bir tüpte 200 μL hücre süspansiyonu ve 200 μL sıvılaştırılmış agarozu birleştirin. Örneğin, dört kuyucuk için 800 μL hücre süspansiyonu ve 800 μL% 2 agarozu birleştirin. Bir miktar karışım kalacaktır, ancak gerekenden biraz daha fazlasını yapmak, pipetleme sırasında hava kabarcıklarını önler.
      1. Bu hücre kültürünü kaplamadan hemen önce tek tek hücre kültürlerine agaroz ekleyin. Agaroz bir dakikadan kısa sürede soğur, bu nedenle hızlı bir şekilde tabaklamaya hazır olun.
   6. Hemen her oyuğa 300 μL hücre / agaroz karışımı ekleyin (Şekil 1C). Şekil 1C, her biri yumurtalıklı ve yumurtalıksız kaplanmış üç hücre koşulunu ve bir ortam durumunu göstermektedir.
   7. Slaytı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO₂'de inkübe edin.
2. Bölünmüş kokültürler
   1. İnce, pürüzsüz plastikten bölücüler kesin (Şekil 2A).
      not: Bu deney, düz ve ince oldukları için steril tek kullanımlık bir medya leğeninin kenarlarını kullanır. Onları kuyunun hipotenüsüne (~ 13 mm) sıkıca sığacak kadar geniş kesin.
   2. Agarozu sıcak bir plaka üzerinde 70 °C'de sıvılaştırın.
   3. 8 oyuklu bölücüyü ITO ile işlem görmüş sürgünün üzerine yerleştirin (Şekil 2B). Bölücü üzerindeki kauçuk taban, sürgüye yapışmaya yardımcı olur, ancak oyuklar arasında sızıntı veya karışım olmamasını sağlamak için agaroz kaplama sırasında sürekli olarak hafif aşağı doğru basınç uyguladığınızdan emin olun.

2. Kurutma Sürgüsü ve MALDI-TOF MS için Hazırlık

1. Dört gün sonra (veya tercih edilen herhangi bir zaman noktasında), hazne bölücüyü agaroz tapalarından ve sürgüden çıkarın (Şekil 1D). Agarozun kenarlarını düz bir spatula ile hazneden nazikçe ayırın ve herhangi bir agaroz tıkacını hareket ettirmemeye dikkat ederek hazneyi yavaşça yukarı doğru çekin. Hareket ederlerse, birbirlerine değmeyecek şekilde nazikçe yeniden konumlandırın.
2. Slaytı 37 °C'lik bir fırına yaklaşık 4 saat boyunca yerleştirin ve her saat 90° döndürün.
   not: Slaytın dönüşü, numune boyunca eşit ısı dağılımını sağlamak için önemlidir.
3. Kuruduktan sonra sürgüyü fırından çıkarın (Şekil 1E).
4. Püskürtücüyü (Şekil 1F) kullanarak aşağıdaki parametrelerle matris çözeltisi uygulayın: sıcaklık = 30 °C, akış hızı = 0.2 mL/dak, geçiş sayısı = 8, yön = CC ve meme mesafesi = 40 mm.
   not: Bir matris püskürtücü yerine, sıvı matrisi uygulamak için sanatsal bir hava fırçası kullanılabilir. Aynı matris çözeltisi püskürtmek için kullanılabilir, ancak yaklaşık iki kat daha fazla çözelti gereklidir. Sürgü dikey olarak asılacak şekilde kenetlendiğinde, matris tabakası görünene kadar sürgüyü yaklaşık bir fit uzaklıktan 90°'lik bir açıyla püskürtün.
5. Slayttaki noktaları temizlemek için 1 μL kalibrant (<500 Da hedefleri için Fosfor Kırmızısı, <5.000 Da) hedefler için bir peptit karışımı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Fosfor Kırmızısı, matris ile karıştırma gerektirmez, ancak peptit karışımı, iyonizasyona yardımcı olmak için matris ile 1: 1 karışım gerektirir. Kalibrantın kurumasını bekleyin.
6. Slaytın her köşesine kalıcı bir işaretleyici kullanarak bir X çizin ve bir kamera veya tarayıcı kullanarak 1.200 dpi'de optik bir görüntü çekin.

Sonuçlar

Şekil 1: Bölünmemiş kokültürün numune hazırlanması için iş akışı. (A) 8 oyuklu hazneyi ITO kaplı sürgünün iletken tarafına yapıştırın. (B) Kokültür koşulları için yarıya bölünmüş yumurtalıkları kuyuların ortasına yerleştirin. (C) 300 μL agaroz/hücre süspansiyonunu doğrudan kuyucuklara ekleyin. Hava kabarcığı olmadığından ve yumurtalığı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Denville	C1017-O	Hücreleri toplamak için
Kırlangıç	PEZGS0816	Millipore Millicell 'den yeniden tasarlandı EZ-sürgülü hazne sürgüsü
Sigma-Aldrich	34998-4L	Püskürtülmüş matris için çözücü
Eppendorf Belediyesi	5810 R	Hücreleri toplamak ve kaldırmak için süpernatan
Bruker Daltonic	8201344	Matris kurutulmuş slayt üzerine püskürtülür
Bruker Daltonic	8201346	Matris kurutulmuş slayt üzerine püskürtülür
Gibco (Gibco)	11995-065	Agaroz ile karıştırılmış ortam
Genesee Bilimsel	22-282	Agaroz alikotları için
Bruker	8237001	Ortak kültür kuluçka platformu
Sigma-Aldrich	A9414-10G	Kaplama için medya ile karıştırılır
Corning	4870	için plastik bölücüleri kesmek için kullanılır Bölünmüş odalar
Bruker Daltonic	8206195	Orta kütle aralığı için kalibrant
Sigma-Aldrich	343-242-5G	Düşük kütle aralığı için kalibrant
Simga-Aldrich	E2758	Hücre kültürü ortamı takviyesi
Peprotech A.Ş.	100-15	Hücre kültürü ortamı takviyesi
Hücre Kanalı	30-005-CR	Hücre kültürü ortamı takviyesi
Sigma-Aldrich	11074547001	Hücre kültürü ortamı takviyesi
Gibco (Gibco)	25030-081	Hücre kültürü ortamı takviyesi
Gibco (Gibco)	15140-122	Hücre kültürü ortamı takviyesi
Fisher Teknolojileri	A116-50	Matris çözümüne eklendi
HTX Teknolojileri		Matris uygulamak için

Gazetesi Gazetesi adet Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi