Antikorla İşlevselleştirilmiş SERRS Nanoprob Tabanlı Görüntüleme: Metastatik Over Kanserini İn Vivo Olarak Tespit Etmek İçin Oldukça Hassas Bir Raman Görüntüleme Tekniği

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Altın Nanostar Çekirdek Sentezi

NOT: Altın nanostarlar, bu deneyde kullanılan SERRS nanoproblarının her iki çeşidi için çekirdek olarak kullanılır.

1. Deiyonize (DI) suda 800 mL 60 mM askorbik asit (_C6H8O6) çözeltisi ve DI suda 8 mL 20 mM tetrakloroaurik asit (HAuCl4) çözeltisi hazırlayın. 4 °C'ye soğutun.
2. Bu reaksiyon adımını 4 °C'de gerçekleştirin. Manyetik bir karıştırma plakasına 800 mL askorbik asit çözeltisi içeren konik bir şişe yerleştirin ve sabit bir girdap oluşturun. Girdaba hızla 8 mL tetrakloroaurik asit çözeltisi ekleyin. Saniyeler içinde nanostarlar oluşacak ve çözelti koyu mavi bir renk alacaktır. Renk herhangi bir zamanda pembe veya mor hale gelirse, nanokürelerin oluşumunu gösterirse, süspansiyon atılmalı ve sentez yeniden denenmelidir.
3. Nanostar süspansiyonunu 50 mL konik tüplere dökün ve 20 dakika (4 ° C, 3.220 x g) santrifüjleyin. Her tüpte yaklaşık 200 μL çözelti bırakarak süpernatanı aspire edin. Tüpün altındaki nanopartikül peletini rahatsız etmemeye dikkat edin.
   not: Süpernatant, kalan asılı nanostarlar nedeniyle mavi bir renk tonuna sahip olmalıdır.
4. Bir mikropipet kullanarak, nanopartikülleri her tüpten askıya almak ve toplamak için çözeltiyi çalkalayın. Peletin bir kısmı tüpün altında sıkıştırılabilir ve kuvvetli pipetlemede bile yeniden süspanse olmaz - bu kısmı atın.
5. Nanopartikül süspansiyonunu bir diyaliz kasetine (MWCO 3.5 kDa) aktarın ve suyu günlük olarak değiştirerek 2 L DI suya karşı en az üç gün diyalize girin. Nanostarları diyalizde 4 °C'de bir aya kadar saklayın ve her 3-4 günde bir su değiştirin.
   not: Nanostarlar, bölüm 2'de tarif edildiği gibi silisasyon reaksiyonu için gerekli olana kadar diyalizde tutulmalıdır.

2. Silika kabuğunun oluşumu

NOT: Raman nanoproblarının iki çeşidi sentezlenir. Sentez prosedürü her ikisi için de aynıdır, tek fark kullanılan Raman raportör molekülüdür (boya). Bu deneyde IR780 perklorat ve IR140 kullanılmıştır. Reaksiyon her zaman plastik kaplarda yapılmalıdır. Sentez oldukça ölçeklenebilir ve istenen enjeksiyon miktarı için ayarlanabilir. Burada, aynı konsantrasyonlar ve reaksiyon süreleri ile gerektiğinde doğrusal olarak daha düşük veya daha yüksek hacimlere ölçeklenebilen bir orta parti sentezi açıklanmaktadır. İki SERRS nanoprob tipi için reaksiyonlar paralel olarak gerçekleştirilebilir. Çapraz kontaminasyonu önlemeye dikkat edin. Sonikasyon, nanopartikül peletlerinin santrifüjlemeden sonra, yıkama adımları sırasında veya nanopartiküllerin bir saatten daha uzun süre saklanmasından sonra yeniden dağıtılması için yapılmalıdır. Sonikasyon, nanopartiküller çözeltiye açıkça süspanse edilene kadar, tipik olarak 1 s boyunca yapılmalıdır.

1. Tüp A'da (50 mL'lik konik tüp), 10 mL izopropanol, 500 μL TEOS, 200 μL DI su ve 60 μL boya (IR780 perklorat veya IR140, DMF'de 20 mM (dimetilformamid)) karıştırın.
2. Tüp B'de (15 mL konik tüp), 3 mL etanol ve 200 μL amonyum hidroksit karıştırın. Çözeltideki herhangi bir kümeyi dağıtmak için nanoyıldızları Adım 1.4'ten sonikasyon yapın ve tüpe 1.2 mL nanoyıldız ekleyin.
   NOT: amonyum hidroksit çözeltisi oldukça uçucudur ve doğru şekilde pipetlenmesi zordur. Pipetlemeyi kolaylaştırmak için ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
3. Tüp A'yı bir girdap karıştırıcısına yerleştirin ve sabit bir girdap oluşturun. Tüp B'nin içeriğini hızla girdaba ekleyin ve yaklaşık 5 saniye karıştırmaya devam edin. Hemen bir çalkalayıcıya aktarın ve oda sıcaklığında 300 rpm'de sallarken 15 dakika reaksiyona girmesine izin verin.
4. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, 50 mL'lik tüpü doldurmak için etanol ekleyerek reaksiyonu söndürün. 3.220 x g ve 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı aspire edin, yaklaşık 0.5 mL çözelti bırakın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. 1 mL etanol ekleyin ve nanopartikülleri yeniden süspanse etmek için bir pipetle çalkalayın. 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 11.000 x g'da 4 dakika santrifüj ederek, süpernatanı aspire ederek ve peleti yaklaşık 1 saniye boyunca ultrasonikasyon ile yeniden süspanse ederek etanol ile 4 kez yıkayın.
6. NOT: Bu aşamada, silislenmiş nanopartiküller, bölüm 3'te açıklandığı gibi işlevsel hale getirilebilir veya bir haftaya kadar 4 ° C'de saklanmak üzere ekstra bir yıkama aşaması ile DI suyunda yeniden süspanse edilebilir.

3. Yüzey İşlevselleştirmesi

NOT: IR780 SERRS nanoprobları, αFR-NP'ler oluşturmak için bir PEG çapraz bağlayıcı aracılığıyla folat reseptörü hedefleme antikorları ile konjuge edilecektir; IR140 SERRS kontrol nanoprobları, nt-NP'ler için pasifleştirici bir PEG tek tabakası ile konjuge edilecektir. Her iki tat da ayrı fakat paralel reaksiyonlarda bir tiyol-maleimid reaksiyonu yoluyla oluşturulur.

1. Nanopartikülleri 4 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüjleyerek, süpernatanı aspire ederek ve peleti ultrasonikasyon ile 1 mL etanol içinde yeniden süspanse ederek iki kez yıkayın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın, ancak 1 mL %85 etanol, %10 3-MPTMS (3-merkaptopropiltrimetoksisilan) ve %5 DI su içinde yeniden dağıtın. Parçacık yüzeyine tiyoller eklemek için oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin.
2. Tiyol ile işlevselleştirilmiş nanopartikülleri 11.000 x g'da 4 dakika santrifüjleyerek yıkayın, süpernatanı aspire edin ve peleti ultrasonikasyonla, iki kez etanolde, iki kez DI'de ve son olarak HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit) tamponunda (10 mM, pH 7.1) ve bir kenara koyun.
3. NOT: MES (2- (N-morfolino) etansülfonik asit) tamponu veya HEPES kullanılmalıdır. PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) gibi daha yüksek tuzluluğa sahip tamponlar, nanopartikül agregasyonunu indükleyebilir.
4. Antikor işlevselleştirilmiş αFR-NP'ler için, 200 μg antikoru (anti-folat bağlayıcı protein antikor klonu [LK26]) on kat molar fazla PEG çapraz bağlayıcı (poli (etilen glikol) (N-hidroksisüksinimid 5-pentanoat) eter N '- (3-maleimidopropionil) aminoetan (CAS: 851040-94-3), dimetil sülfoksit (DMSO)) içinde 500 μL MES tamponunda (10 mM, pH 7.1) 30 dakika boyunca.
5. Antikor-PEG çözeltisini bir santrifüj filtrede (MWCO 100 kDa) santrifüjleyerek fazla çapraz bağlayıcıyı çıkarın ve antikoru konsantre edin. Bu çalışmada kullanılan santrifüj filtreler için, 14.000 x g ve 23 ° C'de 10 dakika santrifüjleme yapın. Filtreyi ters çevirerek ve 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyerek konjuge antikorları yeni bir tüpte geri kazanın.
6. Adım 3.2'deki IR780 nanopartiküllerini antikorlarla birlikte tüpe pipetleyin ve karıştırmak için pipetle çalkalayın. αFR-NP'leri oluşturmak için karışımı oda sıcaklığında en az 30 dakika veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
7. NT-NP'ler oluşturmak için, DMSO'da çözünmüş %1 w / v metoksi sonlu (m), PEG5000-maleimid (CAS: 99126-64-4) Adım 3.2'den IR140 SERRS nanopartiküllerine ekleyin ve 500 μL MES tamponunda reaksiyona girmesine izin verin (10 mM, pH 7.1) oda sıcaklığında en az 30 dakika veya gece boyunca 4 ° C'de.
8. Farelere uygulama için (bölüm 4), her iki nanoprob aromasını 11.000 x g'da 4 dakika boyunca döndürün, çözeltiyi serbest reaksiyona girmemiş antikorlar/PEG ile çıkarmak için süpernatanı aspire edin ve her bir aromayı MES tamponunda (10 mM, pH 7.1) 600 pM konsantrasyonlarında yeniden dağıtın. Nanopartikülleri yeniden süspanse ederken, antikorun denatürasyonunu önlemek için ultrasona gereksiz yere maruz kalmayı en aza indirin.

4. Nanoprob Enjeksiyonu ve Görüntüleme

1. Nanoprobları (αFR-NP'ler ve nt-NP'ler) bölüm 1-3'te açıklandığı gibi hazırlayın ve MES tamponunda (10 mM, pH 7.1) her tipten 300 pM'lik bir nihai konsantrasyon için 1: 1 oranında karıştırın. İsteğe bağlı olarak, küçük (100 μL) konik tüplerde nanoprob aromalarının her biri için 30 pM'lik referans standartları hazırlayın.
2. Her fareye intraperitoneal olarak 1 mL nanopartikül süspansiyonu enjekte edin ve nanopartikülleri periton boşluğu içinde dağıtmak için göbeğe hafifçe masaj yapın. Fareyi yuvasına geri koyun. 25 veya daha fazla dakika sonra, fareyi CO₂ boğulması yoluyla ötenazi yapın.
3. Fareyi sırtüstü pozisyonda cerrahi bir platforma sabitleyin (tüm karın görüntülemesi için platformun dik mikroskop aşamasına monte edilebilir olması gerekir).
   1. Tırtıklı forseps ve diseksiyon makası kullanarak, peritonu ortaya çıkarmak için cildi çıkarın ve tüm karnı ortaya çıkarmak için büyük bir sagital insizyon (2 ila 3 cm uzunluğunda) yapın. Periton fleplerini platforma takın. Periton boşluğunun içini plastik bir fışkırtma şişesi kullanarak en az 60 mL PBS ile yıkayın.
      NOT: Tüm karnın engelsiz görüntülenmesini sağlamak için bağırsakların mobilize edilmesi veya eksize edilmesi gerekir. Eksizyon için, karın boşluğuna kanamayı azaltmak için mezenterik damarların ligasyonu ile rezeke edin.
   2. Alternatif olarak, belirli organları görüntülemek için, PBS yıkamasından sonra bunları eksize edin ve bir mikroskop lamına yerleştirin.
4. Platformu veya slaytı, dik optik konfigürasyona ve görüntüleme için motorlu bir aşamaya sahip bir Raman mikrospektrofotometresine aktarın; 300 mW 785 nm diyot lazerli, mm başına 1.200 oluk ızgaralı, 1.115 ^cm-1 merkezlenmiş ticari bir sistem kullanın.
   1. Raman lazer ile parfokal beyaz ışık optiği kullanarak ilgilenilen alana odaklanın. Görüntülenecek alanı ve istediğiniz çözünürlüğü seçin; Bu raporda yüksek hızlı bir çekim modu kullanıldı (mikroskop aşaması sürekli hareket ederken, 14,2 μm x 200 μm etkili uzamsal çözünürlük; 5x büyütmede, objektifte 100 mW güç ve nokta başına <100 ms pozlama) sürekli lazer aydınlatması altında elde edilen spektrumlar).
      not: Adım 4.1'deki referans nanoproblara sahip tüpler, istenirse, sonraki analiz için dahili referans standartları sağlamak üzere görüntülenen alana yerleştirilebilir. Lazer dışında hiçbir yabancı ışık kaynağının objektife ulaşmadığından emin olun.
5. İsteğe bağlı olarak, numuneyi gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 4 paraformaldehit içinde fiksasyon yoluyla histolojik işleme ve doğrulama için hazırlayın. PBS ile 4 ° C'de 15 dakika boyunca en az iki kez durulayın. Numuneyi, standart histolojik işleme ve parafin gömülene kadar suda% 70 etanol içinde tutun. Tümörlerin histolojik doğrulaması için, parafin bloğunun farklı derinliklerinden kesitler (5 μm kalınlığında) hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyanabilir.