Proksimal Kültür Sistemi: Hücreler Arasındaki Parakrin Sinyalleşmeyi İncelemek İçin Bir İn Vitro Kültür Tekniği

>A. Hücre Hazırlama

1. İnsan primer mezotelyal hücrelerinin izolasyonu ve kültürü
   1. İnsan primer mezotelyal hücrelerini (HPMC'ler) insan omentumundan izole edin ve bunları tam bir büyüme ortamında büyütün [Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 vitaminler] 37 ° C'de ve% 5 CO₂.
      not: HPMC'ler tipik olarak %100 birleşim noktasına kadar büyütülür (Şekil 1A).
2. Yumurtalık kanseri hücrelerinin büyüme koşulları
   1. HeyA8 yumurtalık kanseri hücrelerini 37 ° C ve% 5 CO₂.
      'de tam büyüme ortamında büyütün not: Yaklaşık% 80 birleşmeye kadar büyütülmüş HeyA8 hücrelerini kullanın (Şekil 1B).

B. Hücre Kültürü

1. Proksimal kültür kurulumu
   1. 0,4 μm gözenekli (10⁸ gözenek/^cm2) ve 4,67^cm2 büyüme alanına sahip 10 μm kalınlığında doku kültürü ile muamele edilmiş polikarbonat membrana sahip 6 oyuklu plakalar için Transwell ekleri kullanın. Gerekirse, büyüme yüzey alanına göre ekilen hücre sayısını ölçeklendirerek farklı kesici uç boyutları için optimize edin. Kullanmadan önce tam büyüme ortamını, tripsin ve fosfat tamponlu salini (PBS) 37 °C'ye ısıtın.
2. Eklerin hazırlanması
   1. HeyA8 hücrelerini ekin zarının alt yüzeyine tohumlamak için, eki steril forseps kullanarak ambalajından çıkarın ve 15 cm'lik steril bir kültür kabına ters çevrilmiş olarak yerleştirin.
   2. Ters çevrilmiş eki yerleştirecek derinliğe sahip olduğu için 15 cm'lik bir tabak kullanın veya uygun herhangi bir steril kapla değiştirin. Deneye bağlı olarak, 15 cm'lik tabağa gerekli sayıda ek parça yerleştirin.
   3. Üç kontrolü ve üç deneysel koşulu, eklerin kenarındaki bir işaretleyici ile uygun şekilde etiketleyin.
3. Kanser hücrelerinin hazırlanması
   1. 25 cm2'lik bir şişede (~ 2 x 10⁶ hücre) %80 birleşmede büyüyen HeyA8 hücrelerini tripsinize etmek için, 40-60 saniye boyunca 1 mL tripsin (%0.25) ekleyin ve tripsini 6 mL tam büyüme ortamı ile nötralize edin.
   2. Hücreleri 3 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini 5 mL tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Tripan mavisi boya dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
4. Kanser hücrelerinin tohumlanması
   1. Tam büyüme ortamında 100.000 hücre / mL canlı HeyA8 hücresini askıya alın. Ek parçanın alt kısmında 800 μL'lik tam büyüme ortamında asılı kalan 80.000 HeyA8 hücresini dikkatlice tohumlayın (ters çevrildiği için şimdi yukarı bakmaktadır).
   2. Hücreleri, kubbe benzeri bir şekil oluşturacak şekilde tohumlayın, böylece hücreler ek üzerinde kalır (Şekil 1C). Membranın merkezinden başlayın ve yavaşça pipetlerken eşmerkezli daireler halinde dışa doğru hareket edin. Ortamın dökülmesini önlemek için kenardan 3 mm'den fazla gitmekten kaçının.
      not: Ekilen hücre sayısı, hücrelerin büyüme hızına ve deneyin süresine bağlı olacaktır. Bu proksimal kültür için tohumlanan HeyA8 hücrelerinin sayısı optimize edildi ve hücreler üçüncü günün sonunda %80-90 oranında birleşmiş olacak.
5. >Kanser hücresi bağlanması
   1. 15 cm'lik tabağı kapatın ve ekleri içeren tabağı dikkatlice CO₂ inkübatöre taşıyın. Bu adımda, ek parça üzerindeki ortam ve hücre düşüşünü bozmamak çok önemlidir. Kanser hücrelerinin ek parçaya yapışmasına izin vermek için hücreleri 4 saat boyunca 37 ° C'de bırakın.
6. Mezotelyal hücrelerin hazırlanması
   1. Yaklaşık 4 saat sonra, 75 cm'lik 2 şişede (~ 4 x 10⁶ hücre) 2 mL tripsin (% 0.25) ile 1-2 dakika boyunca% 100 birleşmede büyütülen HPMC'leri tripsinize edin ve tripsini 12 mL tam büyüme ortamı ile nötralize edin.
   2. Hücreleri RT'de 500 x g'da 3 dakika santrifüjleyin, hücre peletini 10 mL tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve tripan mavisi boya dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
7. Mezotelyal hücrelerin tohumlanması
   1. 300.000 hücre / mL canlı HPMC'yi tam büyüme ortamında askıya alın. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 2,5 mL taze tam büyüme ortamı ekleyin. Ekleri içeren 15 cm'lik kabı dikkatlice biyogüvenlik başlığına getirin. Steril forseps kullanarak, eki çevirin ve 6 oyuklu plakanın kuyusuna, dik olacak şekilde, HeyA8 hücreleri tam büyüme ortamına daldırılmış alt yüzeye bağlı olacak şekilde yerleştirin (Şekil 1C).
   2. Tohum: 450.000 HPMC, HeyA8 hücreleri kuyunun dibine bakacak şekilde yüzeye bağlı olarak eklerin iç kısmında 1,5 mL büyüme ortamında asılı kalır (Şekil 1C) veya HPMC kontrolleri için herhangi bir HeyA8 hücresi olmayan eklere. HeyA8 kontrollerine hücresiz 1,5 mL büyüme ortamı ekleyin.
8. >Proksimal kültürün büyütülmesi
   1. Proksimal kültürün CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de ve 72 saat boyunca% 5 CO_2'de büyümesine izin verin. Gerekirse, ortam aşağıdaki gibi doldurulabilir.
      1. Ek parçanın içi için 750 μL'yi çıkarın ve 750 μL taze tam büyüme ortamı ekleyin.
      2. Ek parçanın dışı için (6 oyuklu plaka), 1 mL çıkarın ve 1 mL taze tam büyüme ortamı ekleyin. 1 mL, ortamı tek adımda değiştirmenin rahatlığı için seçilmiştir. İstenirse, bunun yerine 1.25 mL çıkarılabilir ve değiştirilebilir.

Şekil 1: Proksimal kültür sisteminin montajı.(A) Bu panel, insan birincil mezotelyal hücrelerini (HPMC'ler) gösterir. (B) Bu panel HeyA8 yumurtalık kanseri hücrelerini gösterir. Ölçek çubukları = 200 μm (AB). (C) HeyA8 hücreleri, 0.4 μm gözenekli bir transwell ekinin alt yüzeyine ekildi. Hücreler bağlandıktan sonra, ek, büyüme ortamı içeren 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirildi. Mezotelyal hücreler daha sonra üst yüzeye bağlanacak ve zar ile HeyA8 hücrelerinden ayrılacak şekilde ekte tohumlandı. Zardaki 0.4 μm'lik gözenekler, salgılanan faktörlerin değiş tokuşuna izin verdi, ancak hücreler arasındaki herhangi bir doğrudan teması engelledi.