Periton Boşluğu Astarında Yumurtalık Kanseri Metastazının Modellenmesi: Periton Astarının İn Vitro 3D Modelini Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Peters, P. N. et al. İnsan Periton Boşluğunun Organotipik Kültüründe Yumurtalık Kanseri Yayılımının Erken Adımlarının Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, periton boşluğunun astarının in vitro üç boyutlu bir modelinin geliştirilmesini gösteriyoruz. Bu organotipik kültür, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmaya yardımcı olabilir.

Protokol

1. Organotipik Kültürün Kaplanması

1. 10 ml PBS ile durulayarak ve ardından 3 ml% 0.25 tripsin / 25 mM EDTA ile 5 dakikadan fazla olmamak üzere 75 cm2'lik bir kültür şişesinden NOF'u (normal omental fibroblastlar) serbest bırakın. Tripsin'i tam büyüme ortamının hacminin en az 3 katı ile nötralize edin.
2. Tripsinizli hücreleri 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın ve 0.5 g x 3 dakikada döndürün. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 5 ml tam büyüme ortamında geri getirin. Kültür şişesinden geri kazanılan hücreleri saymak için bir hücre sayacı kullanın.
3. Hücreleri, uygun hacimde tam büyüme ortamındaki 100 μl'de 2.000-4.000 NOF plakaya siyah, şeffaf tabanlı, 96 oyuklu bir plaka üzerine seyreltin. Kaplamadan önce hücre karışımına 0.5 μg / 100 μl sıçan kuyruğu kollajen I ekleyin. Hücrelerin %5 CO₂ içinde 37 °C'de nemli bir ortamda en az 4 saat veya hücreler plaka yüzeyine yapışana kadar bekletilmesine izin verin.
4. Adım 1.1 ve 1.2'de açıklanan yöntemlerin aynısını kullanarak HPMC'yi (birincil insan mezotelyal hücreleri) kültür şişesinden serbest bırakın. Hücreleri, 96 oyuklu plakalarda kollajen I ile kaplanmış NOF'un üzerine 50 μl başına 10.000-20.000 HPMC plakaya uygun miktarda tam büyüme ortamında seyreltin. Deneylere başlamadan önce hücreleri nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de en az 18 saat bekletin.
5. Kültür yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden HeyA8 yumurtalık kanseri hücrelerini tam büyüme ortamında. HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri, kopepod cGFP'yi (pCDH-CMV-MCS-EF1) eksprese eden bir lentiviral vektörün ekspresyonu ile floresan olarak etiketlenir. HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri, kullanım gününde (logaritmik büyüme fazı) %80-90 oranında birleşmiş olmalıdır. Hücreleri kültür plakasından serbest bırakın ve birincil hücreler için adım 1.1-1.2'de açıklanan yöntemlerin aynısını kullanarak sayın.
6. Yumurtalık kanseri hücrelerinin, kapağı gevşek bir şekilde kapatılmış konik bir tüpte 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca tam büyüme ortamında iyileşmesine izin verin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pbs	Balıkçı Bilimsel	SH3001304
15 cm kültür yemekleri	BD Biyolojik Bilimler	353025
L-Glutamin ile DMEM	Corning	10-013-Özgeçmiş
MEM Vitaminleri	Corning	25-020-CL
MEM Esansiyel olmayan amino asitler	Corning	25-025-CI
Penisilin-Streptomisin	Corning	30-002-CI
Shaker	Termo-Balıkçı	Maksimum Q 4450
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5702
kuvöz	Termo-Balıkçı	Forma Seri II Su Ceketli CO2 İnkübatör Model 3100
Tripsin EDTA, 1x (% 0.25)	Corning	25-053-CI
T-75 Şişeleri	BD Biyolojik Bilimler	353136
T-175 Şişeleri	BD Biyolojik Bilimler	353112
Pipet uçları	Yağmur	P2, P10, P20, P200 ve P1000
Pipet uçları	Corning	Filtrelenmiş uçlar P2, P10, P20, P200 ve P1000
Hücre Sayacı	Canlandırıcı	kontes
Kontes Hücre Sayma Odası Slayt	Canlandırıcı	C10313
Tripan Mavi Lekesi (% 0.4)	Gibco (Gibco)	15250-061
Kollajen Tip I (Sıçan Kuyruğu)	BD Biyolojik Bilimler	354236
96 kuyulu plaka, şeffaf alt, siyah	BD Biyolojik Bilimler	353219

Serisi