$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Primer Transforme Edilmemiş Stromal Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü
- İnsan dokusunun toplanması ve hazırlanması.
- Karın ameliyatı sırasında çıkarılan 2cm3'lük insan omentum örneklerini alın ve dokuyu hemen RT fosfat tamponlu salin (PBS) içine daldırın (Şekil 1A). 3 cm x 2 cm'lik bir omentum parçası tipik olarak 1 milyon primer insan mezotelyal hücresi (HPMC) ve 200.000 primer insan fibroblastı veya normal omental fibroblast (NOF) verir.
- Doku, toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede (PBS'de < 2 saat) 3 dakika boyunca 0.5 x g'da daldırılan PBS'yi aşağı doğru döndürün ve dokuyu 50 ml'lik konik bir tüpte taze 20 ml PBS'ye aktarın. 15 cm çapında steril bir kültür kabında neşter ile kıyma ile dokuyu 5 mm3 parçalara ayırın (Şekil 1B).
- Birincil insan mezotelyal hücre izolasyonu
- HPMC'yi izole etmek için, kıyılmış dokuyu 50 ml'lik konik tüplere aktarın ve katı parçaların yüzeye çıkması için 1 dakika bekleyin (Şekil 1C ve D). HPMC ve kırmızı kan hücreleri (RBC) alttaki sıvıda bulunacaktır. Sıvıyı tüpün altından yeni bir konik tüpe çıkarmak için bir pipet kullanın. Sıvıyı 3 dakika boyunca 0,5 x g'da döndürün ve süpernatanı HPMC / RBC peletinden aspire edin.
- İşlemi üç kez tekrarlayın: kıyılmış dokuya 20 ml PBS ekleyin, dokunun yükselmesine izin verin, sıvıyı bir pipetle alttan ve HPMC / RBC tüpüne çıkarın, aşağı çevirin ve süpernatanı çıkarın. Tüm dönüşler tamamlandıktan ve süpernatan aspire edildikten sonra, pelet HPMC ve RBC içerecektir.
- Peletteki tüm hücreleri 15 ml tam büyüme ortamında 75cm2'lik bir şişeye yerleştirin (% 10 fetal sığır serumu [FBS],% 1 MEM vitaminleri [93 mg / L,,% 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81.4 mg / L,]% 1 penisilin streptomisin [Pen-Strep, 100 U / ml penisilin ve 100 μg / ml streptomisin]).
- Ek HPMC'leri izole etmek için ikincil bir PBS yıkaması gerçekleştirin.
- İkincil PBS yıkaması için, kalan katı dokuyu 20 ml PBS'de 10 dakika boyunca 200 rpm, 37 ° C'de çalkalayın, ardından dokunun üste çıkması için 1 dakika bekleyin. Sıvıyı tüpün altından yeni bir tüpe çıkarın, 0,5 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
- İkincil PBS yıkamasındaki tüm HPMC / RBC'yi ayrı bir 75 cm2 şişede 15 ml tam büyüme ortamında plakalayın.
- Kalan HPMC'yi izole etmek için, kıyılmış dokuyu hacimce 1: 1 0.25% tripsin 25 mM EDTA: PBS çözeltisinin 20 ml'sinde 200 rpm, 37 ° C derecede 10 dakika çalkalayın. Dokunun yükselmesine izin verin, tüpün altındaki sıvıyı 50 ml'lik yeni bir tüpe toplayın ve 3 dakika boyunca 0,5 x g'da döndürün.
- Süpernatanı aspire edin ve tüm HPMC / RBC'yi ayrı bir 75 cm2 şişede 15 ml tam büyüme ortamında plakalayın.
- Kaplanmış hücreleri nemlendirilmiş bir ortamda 37 ° C ve% 5 CO2'de kültürleyin. Kaplanmış hücreleri, harcanan ortamı çıkarmadan 3. ve 5. günlerde 15 ml tam büyüme ortamı ekleyerek besleyin. HPMC, bölünmeden önce 5-7 gün boyunca kültürlenebilir.
- Orijinal fenotipin farklılaşmasını ve modifikasyonunu en aza indirmek için tüm deneylerde düşük geçişli HPMC (2. bölüme kadar) kullanın. Hücrelerin tüm görüntülerini almak için tercihen plastik diferansiyel girişim kontrast özelliklerine sahip 20x objektif veya faz kontrast özelliklerine sahip 4-20x objektif (mikroskopta faz kontrast filtreleri) olan geniş alan mikroskobu ve immünohistokimyasal 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) boyamayı analiz etmek için parlak alanda 10x objektif () kullanın.
- İmmünohistokimya yaparak HPMC'nin küboidal olduğunu ve sitokeratin 8 ve vimentini eksprese ettiğini doğrulayın (Şekil 2A, C, E).
