Omentumun Yumurtalık Kanseri Hücre Kolonizasyonunun Modellenmesi: Murin Omentum Eksplantlarında Floresan Etiketli Yumurtalık Kanseri Hücrelerinin Sütlü Nokta Kolonizasyonunu Oluşturmak İçin Ex Vivo Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Krishnan, V. et al. Peritoneal Adipozda Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyonunu İncelemek İçin İn Vivo ve Ex Vivo Yaklaşımlar. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, omental eksplant içinde yumurtalık kanseri kolonizasyonunu incelemek için GFP eksprese eden yumurtalık kanseri hücreleri ile kaplanmış bir ex vivo omental organ kültürü oluşturuyoruz. Bu protokol, metastazı teşvik eden sütlü lekeler olarak bilinen omentum içindeki bağışıklık hücresi yapılarını analiz eder.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Samanlı Nokta Kolonizasyonu Ex Vivo

1. Temel ex vivo omental organ kültürü koşullarının oluşturulması
   1. Her bir omentumu tek bir kültür plakası ekine yerleştirin ve %20 FCS içeren 500 μl DME/F12 ortamı içeren 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir oyuğuna yerleştirin. Organ kültürlerini 37 ° C'de% 5 CO₂ ortamında 24 ila 48 saat ve / veya ek zaman noktaları boyunca koruyun. Her koşul için üç bağımsız omenta (üçlü numune) kullanın (örn. ortam türü/zaman noktası).
   2. Deneysel uç noktalardaki dokuların bütünlüğünü doğrulamak için, numuneleri Adım 1.1.3'te açıklandığı gibi sabitleyin ve işleyin. H & E bölümlerinde sağlıklı ve nekrotik adipositlerin sayılması doku bütünlüğünü değerlendirebilir. Mevcut canlı doku yüzdesini formüle etmek için beş biyolojik numuneden en az ~ 120 hücre gereklidir.
   3. Doku fonksiyonunu ölçmek için, omenta'yı (n = 3)% 20 FCS ile 500 μl DME / F12 ortamı içeren 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Omenta'nın ortamı 24 saat boyunca% 5 CO₂ ortamında 37 ° C'de şartlandırmasına izin verin ve ardından bir IL-6 ELISA testinde kullanmak için 250 μl'yi çıkarın.
2. Fare omentumunun SKOV3ip.1-GFP hücreleri ile ex vivo ko-kültürü
   1. Bir T-75 şişesinde 10 ml ortamda 1x10⁶ çözülmüş hücreyi pipetleyerek floresan etiketli hücreleri büyütün ve hazırlayın. Hücrelerin %5 CO₂ ortamında %70 birleşmeye ulaşana kadar 37 °C'de büyümesine izin verin. Ml başına 2 x 10⁶ hücre konsantrasyonunda tripsinize edin ve yeniden süspanse edin.
   2. Kültür ekinin zarına ~ 6 μl doku yapıştırıcısı uygulayın ve kurumaya bırakın. Fazla yapıştırıcıyı çıkarmak için membranı iki kez steril suyla yıkayın. Membranları laminer bir başlık altında havayla kurutun.
   3. Omenta'yı dikkatlice eksize edin ve steril forseps kullanarak yapışkan kaplı membrana tutturun. Ortam eklemeden önce dokunun zara 1 dakika yapışmasına izin verin. Her kültür ekindeki her omentumun üzerine 500 μl hücre süspansiyonu ekleyin. Transwell odasının etrafındaki alanı 2,5 ml DME/F-12 ile doldurun.
   4. Omenta'yı hücre süspansiyonu ile %5 CO₂ ortamında 37 ° C'de 6 saat inkübe edin. Omenta'yı dikkatlice çıkarın ve ~ 10 ml PBS ile yıkayın. Uygun bir floresan görüntüleme sistemi kullanarak floresan kanser hücresi odaklarını görselleştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Diseksiyon Araçları	Güzel Bilim Araçları	Na
Geimsa Belediyesi	Fluka/Sigma Aldrich	48900
% 5 Formalin	Sigma	HT501320
DMEM (Ömer Çiçeğ	Corning	10-013-Özgeçmiş
Pbs	Corning	21-040-Özgeçmiş	Kalsiyum ve Magnezyum içermez
Kollajenaz	Worthington	LS004196
Millicell kültür plakası eki	Kırlangıç	PICM01250
Hücre-Tak	Corning	354240

adet