Katı Örneklerden Primer Over Kanseri Hücrelerinin Elde Edilmesi: Over Tümörü Örneklerinden Epitelyal Over Kanseri Hücrelerinin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Doku İşleme

1. Steril koşullar altında çalışarak, numuneleri 10 ml taze, buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabına (60 mm x 60 mm) aktarın ve steril bir tıraş bıçağı kullanarak mümkün olan en küçük parçalara (2 mm veya daha az) kesin (Şekil 1A ve 1B).
2. Kıyılmış dokuları DMEM'de 10 ml önceden ısıtılmış (30 dakika boyunca 37 ° C) dispas II (2.4 U / ml) içeren 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın ve% 5 CO₂ ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Örneklerin en iyi şekilde sindirilmesini sağlamak için, hücre bulamacını her 5 dakikada bir manuel olarak çalkalayın.
3. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre bulamacını (10 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak) 50 ml'lik bir konik tüpün üzerine yerleştirilmiş bir hücre süzgecine (70 μm ağ) aktarın ve bir şırınga pistonu kullanarak ağa karşı hafif bir basınç uygulayın. Ayrışmamış dokuları (ağın üstünde kalan) atın ve elde edilen hücre süspansiyonunu 50 ml'lik steril konik tüpte toplayın. 4 ° C'de 7 dakika boyunca 320 x g'da santrifüjleyin (Şekil 2).
4. Süpernatanı atın ve hücre peletini %10 FBS içeren 10 ml DMEM içinde yeniden süspanse edin.
5. Hücre süspansiyonunu bir Petri kabında% 5 CO₂ ve 37 ° C'de inkübe edin (Şekil 3).
6. İlk kaplamadan 24 saat sonra ortamı değiştirin. Bu, hücresel kalıntıların ve kültürde bulunan eritrositlerin çoğunun uzaklaştırılmasına izin verir.
7. Takip eden iki hafta boyunca ortamı her üç günde bir değiştirin, ardından birincil EOC kültürleri aşağı akış uygulamaları için hazır hale gelir.

Şekil 1. Klinik örneklerin işlenmesi. A) Katı örnek, 10 ml taze, buz gibi soğuk 1x PBS içeren bir Petri kabına aktarılır. B) Klinik örnekler ayrıca yaklaşık 2 mm boyutunda parçalar halinde kesilmiş

Şekil 2. EOC hücrelerinin ayrışmamış dokulardan ayrılması. Enzimatik sindirimi takiben, klinik örnekler bir hücre süzgecine aktarılır ve sindirilen klinik örnekler üzerine bir şırınga pistonu kullanılarak hafif bir basınç uygulanır. Bu, EOC'nin bağ dokularından mekanik olarak ayrılmasına ve EOC hücrelerinin geri kazanılmasına izin verir

Şekil 3. Elde edilen EOC hücrelerinin süspansiyonunun kaplanması. Ayrışmamış dokuları çıkardıktan sonra, hücre süspansiyonu santrifüjlenir ve %10 FBS içeren 10 ml DMEM içinde yeniden süspanse edilir ve %5 CO2 ve 37 °C'de bir Petri kabında inkübe edilir