Katı Örneklerden Primer Over Kanseri Hücrelerinin Elde Edilmesi: Over Tümörü Örneklerinden Epitelyal Over Kanseri Hücrelerinin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Pribyl, L. J. et al. Katı Örneklerden Primer Yumurtalık Kanseri Hücreleri Elde Etme Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2014)

Bu videoda, katı yumurtalık tümör dokusu örneklerinden primer yumurtalık kanseri hücrelerini izole etmek ve karakterize etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol kullanılarak elde edilen epitel kanseri hücreleri, yumurtalık kanserinin başlamasına ve gelişmesine yol açabilecek süreçleri anlamak için uygundur.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Doku İşleme

1. Steril koşullar altında çalışarak, numuneleri 10 ml taze, buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabına (60 mm x 60 mm) aktarın ve steril bir tıraş bıçağı kullanarak mümkün olan en küçük parçalara (2 mm veya daha az) kesin (Şekil 1A ve 1B).
2. Kıyılmış dokuları DMEM'de 10 ml önceden ısıtılmış (30 dakika boyunca 37 ° C) dispas II (2.4 U / ml) içeren 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın ve% 5 CO₂ ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Örneklerin en iyi şekilde sindirilmesini sağlamak için, hücre bulamacını her 5 dakikada bir manuel olarak çalkalayın.
3. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre bulamacını (10 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak) 50 ml'lik bir konik tüpün üzerine yerleştirilmiş bir hücre süzgecine (70 μm ağ) aktarın ve bir şırınga pistonu kullanarak ağa karşı hafif bir basınç uygulayın. Ayrışmamış dokuları (ağın üstünde kalan) atın ve elde edilen hücre süspansiyonunu 50 ml'lik steril konik tüpte toplayın. 4 ° C'de 7 dakika boyunca 320 x g'da santrifüjleyin (Şekil 2).
4. Süpernatanı atın ve hücre peletini %10 FBS içeren 10 ml DMEM içinde yeniden süspanse edin.
5. Hücre süspansiyonunu bir Petri kabında% 5 CO₂ ve 37 ° C'de inkübe edin (Şekil 3).
6. İlk kaplamadan 24 saat sonra ortamı değiştirin. Bu, hücresel kalıntıların ve kültürde bulunan eritrositlerin çoğunun uzaklaştırılmasına izin verir.
7. Takip eden iki hafta boyunca ortamı her üç günde bir değiştirin, ardından birincil EOC kültürleri aşağı akış uygulamaları için hazır hale gelir.

Sonuçlar

Şekil 1. Klinik örneklerin işlenmesi. A) Katı örnek, 10 ml taze, buz gibi soğuk 1x PBS içeren bir Petri kabına aktarılır. B) Klinik örnekler ayrıca yaklaşık 2 mm boyutunda parçalar halinde kesilmiş

Şekil 2. EOC hücrelerini...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1x PBS, steril	Canlandırıcı	14190-144
Vidalı kapak, polipropilen numune konteyner, steril	Termo Bilimsel
DMEM ortamı, steril	Canlandırıcı	11995-065
Fetal sığır serumu, steril	Termo Bilimsel Hiklon	SH30396.03
100x Penisilin-streptomisin, sıvı	Canlandırıcı	15140-122
Dispase II, steril	Roche	04942 078 001
Küçük ince uçlu forseps ve neşter bıçak, steril	Balıkçı Bilimsel	forseps: 08-953E, bıçaklar: 08-927-5D
Küçük diseksiyon makası, steril	Balıkçı Bilimsel	08-945
15 ml Konik kapaklı tüpler, steril	BD Şahin	352097
50 ml Konik kapaklı tüpler, steril	BD Şahin	352027
10 ml Serolojik pipet, steril	Corning	13-678-11E
6 ml Şırınga pistonu, steril	Tyco Sağlık	8881516911
Naylon filtre (70 μm) hücre süzgeci, steril	BD Şahin	352350
5 cm Petri kabı, steril	Corning	430166
10 cm Petri kabı, steril	Corning	430167