Mezotelyal Klirens Testi: Over Kanseri Sferoidlerinin Mezotelyal Hücre Tek Tabakalarına İnvazyon Yeteneğini Ölçmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Özet

Kaynak: Davidowitz, R. A. et al. İn Vitro Mezotelyal Klerens Testi. J. Vis. Uzm.(2012)

Bu videoda, floresan etiketli hücreler ve hızlandırılmış video mikroskobu kullanarak yumurtalık kanseri sferoidlerinin mezotelyal hücrelerle etkileşimini kantitatif olarak ölçmek için kullanılan bir teknik açıklanmaktadır. Bu in vitro test, metastaz yapan yumurtalık kanseri hücre sferoidleri ile in vivo periton boşluğunu kaplayan mezotelyal hücreler arasındaki etkileşimi modeller.

Protokol

1. Yumurtalık Kanseri Hücresi Küresel Oluşumu

1. RFP eksprese eden yumurtalık kanseri hücreleri% 10 Baz Ortamında (50:50 199 ve MCDB105 karışımı,% 10 inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve% 1 pen-strep içeren özel bir hücre kültürü ortamı) kültürlenir. Etiketlenmemiş yumurtalık kanseri hücrelerinde RFP'yi eksprese etmek için, hücreleri RFP içeren bir plazmit ile transfekte edin ve RFP'yi eksprese eden hücreleri seçin. Alternatif olarak, viral vektörler, floresan proteinleri geçici olarak eksprese etmek için kullanılabilir veya hücreler, kırmızı bir floresan hücre izleyici boyası (Invitrogen) ile önceden inkübe edilebilir.
2. Yumurtalık kanseri sferoidlerini oluşturmadan önce, düşük yapışma özelliğine sahip 96 oyuklu yuvarlak tabanlı kültür kapları hazırlamak gerekir. Düşük yapışma özelliğine sahip kültür plakaları üretmek için, 96 oyuklu bir hücre kültürü kabının her bir oyuğuna 30 μL poli-HEMA (1 ml %95 EtOH içinde 6 mg polihidroksietilmetakrilat) çözeltisi ekleyin. 96 oyuklu plakalar, etanolü buharlaştırmak için 37 °C'lik nemlendirilmemiş bir inkübatörde inkübe edilir ve her oyukta bir poli-HEMA filmi bırakır. Bu poli-HEMA filmi, hücrelerin kuyunun dibine yapışmasını önleyerek hücreleri süspansiyon halinde büyümeye zorlar. [Alternatif olarak, Ultra Düşük Bağlantılı kültür plakaları (Corning) kullanılabilir.]
3. Daha sonra, yumurtalık kanseri hücrelerini tripnize edin, hücreleri 3 dakika boyunca 900 RCF'de bir masa üstü santrifüjde (Heraeus) peletleyin. Süpernatanı aspire edin ve% 10 Temel Ortamda yeniden süspanse edin.
4. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
5. Hücre konsantrasyonunu, 50 μL'de %10 Baz Ortam başına 100 hücre olacak şekilde ayarlayın.
6. 96 oyuklu poli-HEMA kaplı kültür kabının her bir oyuğuna 50 μL eşit şekilde süspanse edilmiş seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.
7. 96 oyuklu plakayı 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe 16 saat boyunca inkübe edin (bu süre, belirli bir hücre hattının çok hücreli sferoidler oluşturması için geçen süreye veya istenen deneysel koşullara bağlı olarak artırılmalı veya azaltılmalıdır) yumurtalık kanseri hücrelerinin bir araya gelmesine izin vermek için, her bir oyukta tek bir çok hücreli sferoid oluşturur. Bazı tümör hücreleri bu dönemde apoptoza uğrayabilir, bu nedenle apoptoz indüksiyonundan önce bir zaman seçmek önemlidir.

2. Mezotelyal Hücre Tek Tabaka Oluşumu

1. Bir hücre kültürü davlumbazında, her bir oyuğa 2 mL 5 μg fibronektin / mL PBS çözeltisi ekleyerek ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ederek 6 oyuklu cam tabanlı bir MatTek kabının kuyucuklarını fibronektin ile önceden kaplayın. MatTek tabaklardaki cam tabanların optik kalitesi, yüksek çözünürlüklü mikroskobik görüntülemeye olanak tanır.
2. GFP eksprese eden mezotelyal hücreler %10 Baz Ortamda kültürlenir. Bir mezotelyal hücre plakasını tripsinize edin, 3 dakika boyunca 900 RPM'de bir masa üstü santrifüjde (Heraeus) döndürün, süpernatanı aspire edin ve% 10 Baz Ortamda yeniden süspanse edin. Burada kullanılan mezotelyal hücreler, elde edildiklerinde zaten GFP'yi eksprese ediyorlardı, ancak etiketlenmemiş mezotelyal hücreler, GFP cDNA içeren bir plazmit ile transfekte edilerek veya hücrelerin yeşil bir floresan hücre izleyici boyasında (Invitrogen) önceden inkübe edilmesiyle üretilebilir.
3. 30 dakikalık fibronektin inkübasyonundan sonra (adım 2.1'de), MatTek kabının kuyularını 2 mL PBS ile yıkayın.
4. PBS'yi aspire edin ve 6 oyuklu MatTek kabının her bir oyuğunda oyuk başına^{6 x10 5} mezotelyal hücre plakasını aspire edin. Mezotelyal hücrelerin tabağa yapışmasını ve bir tek tabaka oluşturmasını sağlamak için MatTek kabını gece boyunca 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.

3. Mezotelyal Hücre Temizleme Testi

1. Yumurtalık kanseri sferoidlerini 96 oyuklu poli-HEMA kaplı plakadan toplamak için bir pipet kullanın.
2. Ortamı, bir mezotelyal hücre tek tabakası içeren 6 oyuklu MatTek kabının bir oyuğundan aspire edin. 2 mL PBS ile bir kez yıkayın. 96 oyuklu plakadaki tüm sferoidleri MatTek kabının bir kuyusuna ekleyin (tabağın görüntülenemeyen kısmına inen sferoidleri hesaba katmak için görüntülenecek sferoid sayısının ~ 3 katı).
3. MatTek çanağını, en az 8 saatlik bir süre boyunca hızlandırılmış görüntüleme yapabilen ters çevrilmiş geniş alanlı bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin. Tek bir deneyde birden fazla küresel interkalasyon olayıyla çanaktaki birden fazla konumu görüntülemek için motorlu bir aşama kullanın. Entegre Mükemmel Odak Sistemine ve düşük [20x-0,75 sayısal diyafram (NA)] büyütme/NA diferansiyel girişim kontrastı (DIC) optiklerine sahip bir Nikon Ti-E Ters Motorlu Geniş Alan Floresan zaman atlamalı mikroskop, 0,52 NA uzun çalışma mesafesi (LWD) kondansatörlü bir Nikon halojen aydınlatıcı, Nikon hızlı (<100 milisaniye anahtarlama süresi) uyarma ve emisyon filtreleri (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter hızlı iletilen ve epifloresan ışık yolu Akıllı Panjurlar, Nikon doğrusal kodlu motorlu sahne, Hamamatsu ORCA-AG soğutmalı şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera, sıcaklık ve CO₂ kontrolüne sahip özel yapım bir mikroskop inkübasyon odası, Nikon NIS-Elements AR yazılımı sürüm 3 ve bir TMC titreşim izolasyon tablosu.
4. Yumurtalık kanseri hücresi sferoidleri tabağın dibine yerleşecek ve mezotelyal hücre tek tabakasına yapışacaktır. 8 saat boyunca her 10 dakikada bir 20+ sferoid/tek katmanlı etkileşimin GFP, RFP ve faz görüntülerini toplayın.
5. RFP eksprese eden yumurtalık kanseri hücresi sferoidleri, GFP eksprese eden mezotelyal hücre tek tabakasını istila ederek tek tabakada bir delik oluşturacaktır. 8 saat sonra, Elements yazılımını (veya resim J gibi başka bir uygun yazılımı) kullanarak GFP görüntülerindeki kara delikleri izleyerek deliklerin boyutlarını ölçün. 8 saatteki delik boyutunu sıfır zamanında karşılık gelen RFP görüntüsündeki sferoidin boyutuna bölerek delik boyutunu ilk küresel boyuta normalleştirin. Bu örnekte, delik boyutu yalnızca bir kez ölçülmüştür, ancak interkalasyon dinamiklerini daha iyi anlamak için sekiz saatlik deney boyunca birden çok kez ölçülebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
OVCA433 Yumurtalık Kanseri Hücreleri			Dr. Dennis Slamon'dan Hediye
ZT Mezotelyal Hücreler			Dr. Tan İnce'den Hediye
Orta 199	Yaşam Teknolojileri tarafından GIBCO	19950
MCDB105	Hücre Uygulamaları A.Ş.	117-500
FBS-ısı etkisiz hale getirildi	GIBCO, Yaşam Teknolojileri tarafından	10082
Kalem-Strep	GIBCO, Yaşam Teknolojileri tarafından	15070
96 kuyulu plaka	Corning	3799
Polihidroksietilmetakrilat (poli-HEMA) 192066-25G	Sigma-Aldrich		Poli-HEMA çözeltisi için 6 mg poli-HEMA tozunu 1 ml% 95 EtOH içinde çözün
EtOH (ÖİK	Pharmco-AAPER	111ACS200	dH20'de% 95'e seyreltin
Hücre kültürü başlığı	Nuaire	NU-425-300
Doku kültürü inkübatörü	Thermo Fisher Bilimsel A.Ş.	3110
Poli-HEMA plakalar için kuluçka makinesi 305	Labline Cihazları	İmparatorluk III
Masa üstü santrifüj	Heraeus Aletleri	75003429/01
6 kuyulu cam tabanlı tabak	MatTek A.Ş.	P06G-1.5-20-F
Fibronektin	Sigma-Aldrich	F1141-1MG
Pbs	Hücre Kanalı	21-040-Özgeçmiş
mikroskop	Nikon Enstrümanları		Entegre Mükemmel Odak Sistemli Ti-E Ters Motorlu Floresan zaman atlamalı mikroskop
mercek	Nikon Enstrümanları		20X-0.75 sayısal apeture
Halojen aydınlatıcı	Nikon Enstrümanları		0.52 NA uzun çalışma mesafeli kondansatör
Uyarma ve emisyon filtreleri	Chroma Teknoloji A.Ş.		GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFPmCherry Ex 575/50 Em 640/50
İletilen ve Epifloresan ışık yolu	Sutter Enstrüman A.Ş.		Akıllı Kepenkler
Doğrusal kodlu motorlu tabla	Nikon Enstrümanları
Soğutmalı şarjlı bağlantılı cihaz kamerası	Hamamatsu A.Ş.	ORCA-AG
Sıcaklık ve CO2 kontrollü mikroskop inkübasyon odası			Özel Yapım
Titreşim izolasyon tablosu	TMC (Türkçe)
NIS-Elements yazılımı	Nikon Enstrümanları		Versiyon 3

Yılı arası Adet Gazetesi ) Serisi Belediyesi Serisi Gazetesi