Kanser Hücreleri için Optimal İnhibitör Tümör Tedavi Alanı Frekansının Belirlenmesi: TTFields'in Kanser Hücresi Canlılığı Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin İnvaziv Olmayan Bir İn Vitro Yöntem

1. TTFields In Vitro Uygulama Sistemi - Taban Plakası ve Çanak Bakımı

1. Bulaşıkları ve bulaşık kapaklarını akan musluk suyu altında durulayın. Daha sonra deiyonize su ile durulayın ve yüzü aşağı bakacak şekilde havayla kurulayın.
2. Önceki bir deneyde bulaşıklara bir kemoterapötik ajan / ilaç eklenmişse, her kabı% 5 hafif deterjan çözeltisiyle doldurun ve gece boyunca bırakın.
   1. Yemeğin içinde herhangi bir deterjan izini önlemek için bulaşıkları akan musluk suyu altında iyice durulayın. Bulaşıkları ve bulaşık kapaklarını deiyonize su ile durulayın ve yüzü aşağı bakacak şekilde havayla kurulayın.
3. Temiz ve kuru bulaşıkları kapaklarıyla birlikte sterilizasyon torbalarına yerleştirin. Torbaları kapatın ve bulaşıkları aşağı bakacak şekilde bir otoklava yerleştirin. 121 °C'den yüksek olmayan sıcaklıkta 30 dakika otoklavlayın.
4. Otoklavı kuru bir programa ayarlayın, otoklav kapağını kısmen açın ve bulaşıkları 30 dakika kurutun.
5. Taban plakasını %70 etanol ile hafifçe nemlendirilmiş bir bezle silin.

2. Deney Düzeneği

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm ekipman ve malzemeler Malzeme Listesi'nde açıklanmıştır. Aşağıdaki tüm adımlar, steril koşullar korunurken bir laminer akış kabini içinde gerçekleştirilmelidir.

1. Bölüm 1'de anlatıldığı gibi temiz ve steril TTFields tabakları ve örtüleri hazırlayın. Taban plakasını %70 etanol ile hafifçe nemlendirilmiş bir bezle silin.
2. TTFields tabaklarını, tabağa hafifçe bastırarak ve tabağın kenarı taban plakasındaki üç pime kilitlenene kadar saat yönünde yaklaşık 5 mm döndürerek kapaklarla birlikte taban plakasına takın. Her tabağın altına 22 mm'lik steril bir lamel (işlenmiş plastik veya cam) yerleştirin.
3. Hücre süspansiyonunu tam büyüme ortamında hazırlayın (Dulbecco'nun U-87 MG ve F98 için modifiye edilmiş Eagle ortamı; A2780 ve OVCAR-3 için RPMI; Malzeme Listesi'nde açıklandığı gibi eklenmiştir).
   NOT: Hücre konsantrasyonları, hücre tiplerine ve deney süresine bağlıdır; Deneyin sonunda %80-90 birleşik hücre büyümesi aşılmamalıdır.
   DİKKAT: İnsan hücre hatları biyolojik bir tehlike oluşturabilir ve uygun güvenlik önlemleriyle birlikte kullanılmalıdır.
4. 200 μL hücre süspansiyonu (genellikle 72 saatlik bir deney için 200 μL'de 5.000-20.000 hücre, iki katına çıkma süresine bağlı olarak) her lamellerin ortasına bir damla olarak yerleştirin ve bulaşık kapaklarıyla örtün.
5. Hücreler yapışana kadar bir CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin; Bu aşamada bir gece inkübasyon mümkündür.
6. 200 veya 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak sıvıları damladan aspire edin.
7. Her tabağı doldurmak için 2 mL tam büyüme ortamını nazikçe pipetleyin. Pipetlemek için steril bir uç kullanın ve ara sıra sürgünün altına sıkışan hava kabarcıklarını serbest bırakmak için lamel kenarlarına yumuşak bir şekilde vurun.
8. Bulaşıkları kapaklarıyla kapatın ve TTFields tedavisinin başlangıcına kadar 37 °C'de bir CO₂ inkübatörüne koyun.

3. TTFields Uygulaması

1. Taban plakalarını ekli TTFields kapları ile birlikte soğutulmuş bir CO₂ inkübatöre aktarın.
   NOT: İn vitro TTFields uygulaması ısı üretecektir; Bu nedenle, bulaşıkların ısınmasını telafi etmek için soğutmalı bir inkübatör gereklidir. Daha yüksek TTFields yoğunlukları daha fazla ısı üretecek ve daha düşük inkübatör ortam sıcaklıkları gerektirecektir (bkz. Tablo 1). Klinik olarak anlamlı TTFields yoğunlukları, TTFields uygulaması için inkübatör sıcaklığı 18-30 °C aralığında olduğunda elde edilir.
2. Düz kablo dişi konektörünü taban plakasına bağlayın. TTFields jeneratörünü açın.
3. TTFields in vitro uygulama sistemi yazılımını başlatın ve deney ayarlarını seçin.
   1. Yeni bir deneme tanımlayın. Bilgisayar ekranındaki yazılım kullanıcı arabirimine deneyin adını ve deney sahibini yazın. Her çanak veya taban plakası için frekansı ve hedef sıcaklığı ayarlayın.
4. Yazılımı kullanarak TTFields uygulamasını başlatın.
5. Tüm bulaşıkların doğru şekilde bağlandığını ve monitörde açık mavi göründüğünü doğrulayın. Bir çanak kırmızı bir çerçeve ile daire içine alınmışsa (düzgün bağlanmadığı anlamına gelir), hafifçe aşağı bastırın ve temas noktaları eski haline gelene ve çanak açık mavi görünene kadar yavaşça ileri geri döndürün.
6. TTFields in vitro uygulama sistemini 24 saate kadar çalışır durumda bırakın.
7. Deney bitiş noktasına ulaşırsa, yazılımdaki DENEYİ SONLANDIR düğmesine tıklayarak denemeyi durdurun ve 5. adıma geçin. Değilse, DENEMEYİ DURAKLAT'a tıklayın.
8. Düz kablo konektörünü taban plakasından çıkarın. Bulaşıkların bulunduğu taban plakasını inkübatörden laminer akış kabinine çıkarın.
9. Her 24 saatte bir tüm bulaşıklardaki ortamı değiştirin ve taban plakasını soğutmalı inkübatöre geri koyun. Düz kabloyu kullanarak taban plakasını jeneratöre bağlayın. DEVAM düğmesine tıklayarak deneye devam edin.

Tablo 1. Kuluçka makinesi ortam sıcaklığı ve TTFields kabının içindeki beklenen TTFields yoğunlukları.

4. Kontrol Örnekleri

>Not: Kontrol hücrelerini, TTFields uygulaması hariç, TTFields ile tedavi edilen hücrelere benzer koşullarda büyütün.

1. TTFields ile muamele edilmiş numunelerin kaplanması için kullanılan aynı süspansiyona sahip ve benzer bir yüzey üzerinde plaka kontrol numuneleri.
2. Kontrol kaplarını 37 °C'de bir CO₂ inkübatöre yerleştirin.
3. TTFields ile muamele edilmiş bulaşık ortamı koşullarına uyması için bulaşıklardaki ortamı her 24 saatte bir değiştirin.

5. Deney Sonu

1. DENEYİ SONLANDIR'a tıkladıktan sonra yazılımın sistemden tüm kayıtları almasını ve kayıtları bilgisayara kaydetmesini bekleyiniz.
2. Tüm bulaşıkların deney planına göre işlendiğini doğrulamak için her bir taban plakasının sıcaklık, akım ve direnç günlük dosyalarını gözden geçirmek için RAPORLAR düğmesini kullanın.
   NOT: Tüm raporlar ve günlükler, deneyin bitiminden sonra bilgisayara kaydedilir ve herhangi bir zamanda gözden geçirilebilir.
3. TTFields jeneratörünü kapatın.
4. Düz kabloyu taban plakasından ayırın ve inkübatörden çıkarın.
5. Seramik bir tabağı çıkarmak için, taban plakasından kilidini açmak için tabağı aşağı bastırın ve saat yönünün tersine çevirin.
6. Bulaşıkları laminer akış kabinine alın ve lamelleri aseptik olarak çıkarın. Daha fazla inceleme ve değerlendirme için taze orta veya fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril Petri kaplarına aktarın.