$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tavuk yumurtası embriyolarını içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Yumurtaların hazırlanması
- Yumurtaları almadan önce, üreticinin talimatlarına göre yumurta kuluçka makinesini monte edin ve %37.8 nem ile 100 °C'ye (60 °F) kadar dengeleyin.
not: Kontaminasyon risklerini en aza indirmek için, nemi kontrol etmek için otoklavlanmış su kullanılabilir.
- Sertifikalı laboratuvar sınıfı bir yumurta tedarikçisinden döllenmiş Rhode Island Red tavuk yumurtası aldıktan sonra, kabukların yüzeyini kağıt havluyla kurulayın. Yapışan malzemeyi çıkarmak için hafifçe nemlendirilmiş bir kağıt havlu kullanılabilir. Hemen kurulayın.
not: Kabuğun 43,3 °C'nin altındaki sıvıyla ıslatılması yumurtaya bakteri bulaştırabilir. Yumurtaları yıkamayı veya dezenfekte etmeyi seçerse, sıvının sıcaklığı 43.3-48.9 °C arasında olmalıdır. Daha yüksek sıcaklıklar yumurtaları kaynatabilir. Dezenfektan seçimi, endişeye neden olan mikroorganizmalara göre yapılmalıdır.
- Yumurtanın üzerindeki tarihi etiketlemek için bir kalem veya keçeli kalem kullanın. Bu, geliştirme günü 0 olarak kabul edilir.
- Yumurtaları yumurta kuluçka makinesine yerleştirin ve CAM gelişimine izin vermek için rotasyonla en az 7 gün kuluçkaya yatırın. Otomatik bir döndürücü kullanılabilir veya yumurtalar günde 2-3 kez 180° döndürülebilir.
2. Yumurtaların açılması
>NOT: Yumurtaların açılması, TAT tamamen geliştiğinde yapılmalıdır. Bu genellikle geliştirme günü 7 veya 8'dir.
- Bir biyogüvenlik kabinini %70 etanol ile dezenfekte edin. Benzer şekilde, bir yumurta rafı, yumurta mumcusu, keçeli kalem, silisyum karbür taşlama taşı ve dairesel kesme tekerleği olan kablosuz döner alet, 18 G iğne, çeyrek inç vakum borulu pipet kontrolörü, koli bandı, ofis makası, kavisli makas, Semken (veya benzeri) forseps, pamuk topları ve 6 x 7 cm şeffaf film örtüyü dezenfekte edin ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Mümkün olduğunda steril, tek kullanımlık veya otoklavlı aletler kullanın.
- Yumurta döndürücüyü kapatın. Yumurta rafındaki biyogüvenlik kabinine yaklaşık 1-3 yumurta yerleştirin. Karanlıktayken, hava hücresini tanımlamak için yumurta mumunu yumurta kabuğuna yerleştirin. Hava hücresinin konumunu işaretleyin.
not: Yumurta mumundan gelen aydınlatma yoğunluğu, yumurtanın içini görselleştirmek için çok önemlidir. Hava hücresinin veya damar sisteminin görülmesi sürekli olarak zorsa, yumurta mum pillerini değiştirmeyi deneyin.
- Büyük bir kan damarı ağı bulmak için yumurta mumunu kabuğun üzerine hareket ettirin. Gerekirse yumurtayı döndürün. İdeal bir damar sistemi, yumurtanın ortasına yakın bir yerde dallanacaktır. İmplantasyon için kullanılacak damar sisteminin üzerine çizmek için bir işaretleyici kullanın.
- Kaputtaki ışığı açın. Silisyum karbür taşlama taşı ile donatılmış kablosuz bir döner alet kullanarak, doğrudan hava hücresinin merkezinin üzerine kabukta küçük bir delik açın. Kabuğun çoğu çıkarılana kadar delin, ancak beyaz, iç zar sağlam.
not: Damar sistemini hedeflemeden önce hava hücresi üzerinde delme yapmak, söz konusu yumurta kabuğunun kalınlığının CAM ve damar sistemi yerine hava hücresi üzerinde belirlenmesine izin verir. CAM veya damar sistemi bozulursa, yumurta implantasyon için kullanılamaz.
- Hava hücresi için yapıldığı gibi vasküler pencerenin açılacağı başka bir küçük delik açın ve açın (adım 2.4).
- 18 G'lik bir iğne kullanarak, hava hücresi ve damar sistemi üzerindeki beyaz, iç zarı nazikçe delin. Kabuğa nüfuz edemiyorsanız, biraz daha dikkatlice delin. Beyaz, iç zarın (CAM'ın değil) delinen alanın tamamı boyunca bozulduğundan emin olun. Membran parçasının çıkarılmasına gerek yoktur.
not: Bu adım sırasında CAM veya damar sistemi bozulursa, yumurtayı atın. Delinmiş bir delikten kan veya albümin sızıyorsa hasar belirgindir.
- Kaput ışığını kapatın. Yumurta mumlayıcısını kullanarak, hava hücresinin yumurtanın ucundan damar sistemi üzerindeki alana aktarıldığını doğrulayın. Gerekirse, bir pipet kontrol cihazına yerleştirilen vakum hortumunu orijinal hava hücresinin üzerindeki deliğin etrafına yerleştirin ve hava hücresini hareket ettirmek için kısa aralıklarla hafifçe emme uygulayın.
- Hava hücresinin yeni konumunu, hava-CAM sınırının yaklaşık 0.5 cm içinde çizmek için bir işaretleyici kullanın. Yeni hava hücresinin hemen üzerine bir parça koli bandı yapıştırın. Gerekirse, bandı uygun bir boyuta kesmek için standart ofis makası kullanın.
not: Bant, kabuktan geçen hava akışını bozabilir ve hava hücresini tamamen kaplamak için gerekenden daha büyük olmamalıdır.
- Yumurtaları, yeni hava hücresi yukarı bakacak şekilde dönmeden ısıtmak için kuluçka makinesine geri koyun. Kalan yumurtaların açılması için 2.2-2.9 adımlarını tekrarlayın.
not: Protokol burada duraklatılabilir. TAT gelişiminin kalitesinden emin değilseniz, kalan yumurtaları açmadan önce az sayıda yumurta 2.16 adımından geçmelidir.
- Yer değiştirmiş hava hücreleri ile yaklaşık 1-3 yumurtayı biyogüvenlik kabinindeki yumurta rafına yerleştirin.
not: Açılan yumurtaya kontaminasyon girmesini önlemek için özen gösterilmelidir. Bu nedenle, yumurtaları her zaman bir biyogüvenlik kabini içinde açın ve mümkün olduğunca steril alet ve ekipman kullanın.
- Dairesel bir kesme diski ile donatılmış kablosuz bir döner alet kullanarak, adım 2.8'de çizilen hava hücresi sınırı üzerinde küçük bir çizgi kesin. CAM veya damar sistemini bozmamak için bunun gerçek hava-CAM sınırının yaklaşık 0.5 cm içinde olduğundan emin olun. Kabuğu tamamen kesin, ancak CAM veya damar sistemini bozacak kadar derine nüfuz etmemeye dikkat edin.
- Kavisli makas kullanarak, kabukta bir pencere oluşturmak için kalan hava hücresinin etrafını kesin.
not: Çıkarılan kabukta kan veya zar varsa, yumurta implantasyon için uygun değildir. Yumurtaların büyük bir kısmı temiz bir şekilde açılmazsa, daha iyi CAM oluşumuna izin vermek için kalan yumurtaları açmak için en az 1 gün daha beklemeyi düşünün. Kalan yumurtaların kabukları delinmemişse, yumurtaların kuluçka makinesi içindeki dönüşüne devam edilmelidir.
- Embriyonun canlılığını doğrulayın. Canlı embriyolar, geniş damar sistemi, berrak albümin, embriyo hareketi veya görünür bir kalp atışı gösterecektir.
- Semken forseps kullanarak, steril bir pamuk topundan küçük pamuk parçaları çekin. Kabuk tozunu ve kalıntıları temizlemek için CAM yüzeyini nazikçe kurulayın.
not: Döküntülerin kaldırılması, yumurtaların açıldığı gün yapılmalıdır.
- Kabuk açıklığını dörtte bir parça 6 x 7 cm şeffaf film örtü ile kapatın.
- Yumurtaları kuluçka makinesine geri koyun. Yumurtanın, açılan pencere yukarı bakacak ve CAM'ın şeffaf film sargısına temas etmeyecek şekilde güvenli bir şekilde oturduğundan emin olun. Yuvarlanmaya devam eden yumurtaları desteklemek için bir parça yumurta rafı, yumurta döndürücünün kenarı veya başka bir uygun öğe kullanın.
- Kalan tüm yumurtaların açılması için 2.10-2.16 adımlarını tekrarlayın.
not: Yumurtaların açılmasının implantasyon ile aynı gün tamamlanmasına gerek yoktur. En az 1 gün beklemek, kabuğu açılarak canlılığı tehlikeye giren yumurtaların ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilir.