Tavuk Korioallantoik Membran Tabanlı Kanser Modellemesi: Kanser Hücresi Tümörigenezi ve Metastazı Çalışmak İçin Bir In Ovo Model

Özet

Kaynak: Sharrow, A. C. et al. Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri İncelemek için Tavuk Korioallantoik Membran İn Vivo Modelini Kullanma. J. Vis. Uzm.(2020)

Bu videoda, bir in ovo model oluşturmak için kanser hücrelerinin bir tavuk koryoallantoik zarına implantasyonunu açıklıyoruz. Model, jinekolojik kanserin ilerlemesini incelemek için yumurtalık kanseri hücrelerini başarıyla aşılar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kanser hücresi süspansiyonunun transplantasyon için hazırlanması (seçenek 1)

NOT: Bu, ideal olarak 7. ve 10. günler arasında gerçekleşmesi gereken implantasyondan hemen önce tamamlanmalıdır. İmplantasyon tarihi ile ilgili daha fazla bilgi için lütfen 3. veya 4. adımın başındaki notlara bakın. Bu yaklaşım, tüm hücre hatları ve kültürlenmiş böbrek kanseri tümör sindirimi için kullanıldı.

1. Hücre dışı matris çözeltisini buz üzerinde çözün.
2. Mekanik ve/veya enzimatik sindirim kullanarak, implante edilen hücre tipine uygun bir yöntem kullanarak tek hücreli bir süspansiyon elde edin.
3. İmplantasyon için uygun bir ortama implante edilecek toplam hücre sayısını yeniden askıya alın. Yumurta başına 1-2 x 10⁶ hücreli implantlar tipiktir.
   not: Hücre hatlarının implantasyonu için kullanılan besiyeri, tipik olarak, FBS veya serum replasmanı içeren, hücrelerin kültürlenmesi için kullanılan tam besiyeridir. Tümör özetlerinin implantasyonu tipik olarak aynı kanser türündeki hücre dizilerini kültürlemek için kullanılan tam ortamı kullanır. Bununla birlikte, deneysel olarak gerekirse ortam formülasyonunda ayarlamalar yapılabilir. Tümör gelişimi ve büyümesi üzerindeki etkilerin ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir.
4. Kullanılan hücrelere uygun bir santrifüj hızı ve süresi kullanarak hücreleri peletleyin. Tipik hızlar 250-300 x g ve süreler 5-10 dakikadır.
5. Pipetleme ile süpernatanı peletlenmiş hücrelerden çıkarın. Artık ortamdaki hücreleri, hafifçe vurma veya pipetleme yoluyla mekanik olarak yeniden süspanse edin. Soğuması için buzun üzerine koyun. Uygun boyutta bir pipet kullanarak hücrelerin ve ortamın hacmini ölçün.
6. İmplantasyon hacimlerini, 1-2 x 10⁶ hücre, yumurta başına 20-100 μL'lik bir hacme implante edilecek ve nihai hücre dışı matris konsantrasyonu 2.7-4 mg / mL protein olacak şekilde hesaplayın. Bu hesaplamaya göre ortam, istenen herhangi bir büyüme faktörü veya katkı maddesi ve hücre dışı matris çözeltisi ekleyin. İmplant yapmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
   not: Adım 1.3 ve 1.6'daki hesaplamalar için, gruptaki tüm yumurtalar için yeterli bir hacim sağlamak için en az yarım yumurta implantından oluşan ekstra bir hacim dahil edilmelidir. Yumurtalık kanseri hücre hatlarının implantasyonu için (yani, SKOV3 ve ID8), yumurta başına 10⁶ hücre implante edildi. Renal hücreli karsinom hücre hattı RENCA'nın implantasyonu için, sindirilmiş primer insan renal hücreli karsinomundan türetilen kültürlenmiş hücreler, prostat kanseri hücre hatları (yani, CWR, C4-2 ve MyC-CaP) ve mesane kanseri hücre hatları (yani, HT-1376 ve T24), 2 x 10⁶ hücre implante edildi.

>2. Tümör parçalarının implantasyon için hazırlanması (seçenek 2)

>NOT: Bu, ideal olarak 7. ve 10. günler arasında gerçekleşmesi gereken implantasyondan hemen önce tamamlanmalıdır. İmplantasyon tarihi ile ilgili daha fazla bilgi için lütfen 3. veya 4. adımın başındaki notlara bakın. Primer over ve mesane kanserleri tümör parçaları olarak implante edildi.

1. Hücre dışı matris çözeltisini buz üzerinde çözün. İstenen herhangi bir büyüme faktörü veya katkı maddesi içeren uygun bir ortamda 2.7-4 mg / mL'lik bir nihai protein konsantrasyonuna seyreltin. Buzda kal.
   not: Tümör parçalarının implantasyonu tipik olarak aynı kanser türündeki hücre dizilerini kültürlemek için kullanılan tam ortamı kullanır. Bununla birlikte, deneysel olarak gerekirse ortam formülasyonunda ayarlamalar yapılabilir. Tümör aşılaması ve büyümesi üzerindeki etkilerin ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir.
2. Bir neşter veya makas kullanarak, taze tümörden parçaları çıkarın. İdeal boyutlar her iki tarafta 2-5 mm arasında değişir. İmplant yapmaya hazır olana kadar dokuları ortama daldırın.

3. Yapışmaz halka kullanarak implantasyon (seçenek 1)

>NOT: CAM tamamen gelişmişse, hücreler 7. geliştirme gününden itibaren implante edilebilir. İmplantasyon, yumurtadan çıkmadan önce herhangi bir zamanda gerçekleşebilir, bu da tümör gelişimi ve istenen deney için yeterli zamana izin verir, ancak embriyonun bağışıklık hücrelerinin döllenmeden sonraki 10. gün civarında mevcut olmaya başladığını unutmayın. Tümör büyüme hızı, hücre tipine göre önemli ölçüde değişir ve ilgilenilen hücre tipi için ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Yumurtalık kanseri ve prostat kanseri hücreleri yapışmaz halka yöntemi kullanılarak implante edildi. Yapışmaz bir halka mevcut olmadığında, bir pipet ucunun benzer boyutta kesilebileceğini ve kullanılabileceğini unutmayın.

1. Bir biyogüvenlik kabinini ve gerekli tüm araçları dezenfekte etmek için %70 etanol kullanın: yumurta rafı, kavisli iris forsepsleri, yapışmaz halkalar (1/4 inç iç çap), cam karıştırma çubuğu, uygun hacimli pipetler ve uçlar, 6 x 7 cm şeffaf film sargısı, ofis makası ve keçeli kalem veya kurşun kalem. Mümkün olduğunda steril, tek kullanımlık veya otoklavlı aletler kullanılmalıdır.
2. İmplante edilecek yumurtaları bir biyogüvenlik kabinindeki bir yumurta rafına yerleştirin. Yönetilebilir sayıda yumurta seçin. Altıya kadar tipiktir. Onlarla çalışırken yumurtaların önemli ölçüde soğumasına izin vermekten kaçının.
3. Kabuk parçalarının çekilmesini önlemek için kenarları açık pencereye doğru yuvarlayarak şeffaf film sargısını kabuktan çıkarın. Yumurtaların canlı ve sağlıklı olup olmadığını kontrol edin. İdeal yumurtalar, açılan alanın merkezinde büyük bir damara sahip olacak ve ondan daha küçük damarlar dallanacaktır.
4. Kavisli iris forsepsleri kullanarak, ideal olarak bir dallanma noktası üzerinde, damarın üzerindeki CAM'a steril, yapışmaz bir halka yerleştirin. CAM'yi nazikçe aşındırmak için steril bir cam karıştırma çubuğu kullanın.
5. Adım 1.6'dan itibaren hücre süspansiyonunu yapışmaz halkanın ortasına pipetleyin. Alternatif olarak, adım 2.2'den yapışmaz halkanın merkezine bir tümör parçası yerleştirmek için forseps kullanın ve adım 2.1'de üretilen hücre dışı matris çözeltisinin 20-50 μL'si ile örtün.
6. Açıklığı dörtte bir parça 6 x 7 cm şeffaf film sargı ile kapatın. Yumurtaları uygun bir implant işaretiyle etiketleyin.
   not: Bir grup içindeki yumurtaların numaralandırılması, uzunlamasına gözlemleri kolaylaştırır.
7. Yumurtayı kuluçka makinesine geri koyun. Kabuğun ağzının dik durduğundan ve yumurtanın sağlam olduğundan emin olun.
   not: Yumurtalar, dönmeden bir yumurta kuluçka makinesine geri gönderilebilir. Alternatif olarak, CO₂ devre dışı bırakılmış 37-38 °C'lik bir hücre inkübatörü ve %50-80 olması gereken nemi izlemek için bir higrometre kullanılarak yüksek implant sonrası canlılık elde edilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
010 Teflon (PTFE) Beyaz 55 Duro Shore D O-Ringler	O-Ring Mağazası	TEF010	Hücre tohumlama için yapışmaz halka. 1/4 "ID X 3/8" OD X 1/16 "CS Politetrafloroetilen (PTFE).
hassas işletme makası; Kıvrımlı; keskin-keskin; 30 mm bıçak uzunluğu; 4-3/4 inç Toplam Uzunluk	Roboz Cerrahi	RS6703	Bu bir örnek olarak verilmiştir. Benzer herhangi bir kavisli makas da işe yarayacaktır.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Alet Kiti	Dremel Gölü	8050-N/18	Bu kit gerekli tüm araçları içerir
Döllenmiş tavuk yumurtası (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA Laboratuvar Yumurtaları A.Ş.	Yok	Bu tedarikçi yalnızca bölgesel olarak teslimat yaptığı için yerel bir yumurta tedarikçisinin tanımlanması gerekecektir.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Yumurta Kuluçka Makinesi Combo Kit	Kuluçka Ambarı	HB1588D-YOK-1102-1588-1357	Diğer yumurta kuluçka makineleri kullanılabilir, ancak güvenilirliklerinin doğrulanması gerekir. İmplantasyondan sonra, CO2 devre dışı bırakılmış bir hücre inkübatörü de kullanılabilir.
Incu-Parlak Soğuk Işık Yumurta Mum	Kuluçka Ambarı	1102	Diğer mumlar da kullanılabilir; ancak, test ettiklerimiz arasında bu tercih edilir. Bu mumcu, yukarıda belirtilen inkübatör kitine dahildir.
Matrigel Membran Matrisi HC; LDEV İçermez	Corning	354248	Hücre dışı matris çözeltisi
SKOV3	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-77	İnsan yumurtalık kanseri hücre hattı.
Kauçuk Polis ile Karıştırma Çubukları; 5 mm çap, 6 inç. uzunluk	Birleşik Bilimsel Malzemeler	GRPL06	Bu bir örnek olarak verilmiştir. Benzer herhangi bir cam karıştırma çubuğu da işe yarayacaktır.
Numune forsepsleri	Elektron Mikroskobu Bilimleri	72914	Bu bir örnek olarak verilmiştir. Biyolüminesans görüntüleme için kabuğu çıkarmak için kullanılan forseps, 3 mm genişliğinde uçlar ile yaklaşık 12,8 cm uzunluğundadır.

Serisi Serisi Radarı Serisi