Agaroz Spin Down Testi: Histolojik Analiz için Organoidleri Gömme Tekniği

1. Histoloji için Organoid İşleme: Agaroz Spin Down Yöntemi

>NOT: Bu protokol, Vlachogiannis ve arkadaşları tarafından yapılan önceki bir yayından uyarlanmıştır. Tüm organoid popülasyonlarını başarılı bir şekilde gömmek için agaroz gömmeyi içeren bir adım ekledik.

1. Mevcut medyayı kuyudan çıkarın. Bazal membran kubbelerini aspire etmemeye dikkat edin.
2. Eşit (1. adımdan çıkarılan ortamın hacmine eşit) bir hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin ve 4 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
3. Bir pipet kullanarak bazal membran kubbesini yerinden çıkarın ve bir pipet ucu kullanarak bazal membran kubbesini ezin. Ayrışmış kubbe ve hücre geri kazanım solüsyonunu 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın.
4. 300 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı (hücre kurtarma çözeltisi) çıkarın. Tüm süpernatantları, son peletleme adımında organoidlerin varlığı onaylanana kadar sonuna kadar ayrı tüplerde saklayın.
6. İstenilen hacimde (Tablo 1) soğuk PBS ekleyin ve peleti mekanik olarak rahatsız etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
7. 300 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
8. Süpernatanı (PBS) çıkarın.
9. Peletleri, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %4 PFA'lık eşleşen bir hacimde (örneğin, 24 oyuklu plaka kültürü koşulundan bir pelet için 500 μL, Tablo 1) sabitleyin.
10. Fiksasyonu takiben, 300 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
11. Süpernatanı (PFA) çıkarın.
12. Eşleşen hacimde yıkayın (ör., 24 oyuklu plaka kültürü koşulundan bir pelet için 500 μL, Tablo 1) PBS ve 300 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
13. Sıcak agaroz hazırlayın (PBS'de% 2 agaroz).
    not: Burada, donmuş bölümler için hücre peletleri, 200 μL OCT bileşiği içinde doğrudan yeniden süspanse edilebilir.
14. Hücre peletini 200 μL agaroz (PBS'de% 2) içinde yeniden süspanse edin.
    1. Agaroz ekledikten hemen sonra, 1 mL şırıngaya bağlı 25 G'lik iğneyi kullanarak hücre peletini 1.5 mL'lik tüpün duvarından nazikçe ayırın. Şekil 1'de gösterildiği gibi, hücre peleti 1.5 mL'lik tüpün duvarından fiziksel olarak ayrılmazsa, agaroz gömme işlemi sırasında hücre peletinin tamamını veya bir kısmını kaybetme riski vardır.
15. PBS'deki %2'lik agaroz tamamen katılaşana kadar bekleyin.
16. 1 mL şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğne kullanarak katılaşmış agaroz bloğunu 1.5 mL'lik tüpten ayırın.
17. Hücre peletini içeren ayrılmış agaroz bloğunu 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
18. Tüpü% 70 EtOH ile doldurun ve doku dehidrasyonu ve parafin gömme için geleneksel protokolü kullanarak daha fazla ilerleyin.

Tablo 1: Bir kubbe için gereken tohumlama yoğunluğu, bazal membran hacmi ve orta hacim

Şekil 1: Başarılı agaroz gömme için önemli bir adım. Hücre peletini 1.5 mL'lik tüpün duvarından ayırmak için bir işlem.