Agaroz Spin Down Testi: Histolojik Analiz için Organoidleri Gömme Tekniği

Özet

Kaynak: Lee, S. et al. Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Türetilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, 3D prostat kanseri organoidlerini agaroza gömmek için bir spin-down testi gerçekleştiriyoruz. Bu gömülü organoidler, kanser büyümesini ve gelişimini incelemek için daha fazla histopatolojik analiz için kullanılabilir.

Protokol

1. Histoloji için Organoid İşleme: Agaroz Spin Down Yöntemi

>NOT: Bu protokol, Vlachogiannis ve arkadaşları tarafından yapılan önceki bir yayından uyarlanmıştır. Tüm organoid popülasyonlarını başarılı bir şekilde gömmek için agaroz gömmeyi içeren bir adım ekledik.

1. Mevcut medyayı kuyudan çıkarın. Bazal membran kubbelerini aspire etmemeye dikkat edin.
2. Eşit (1. adımdan çıkarılan ortamın hacmine eşit) bir hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin ve 4 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
3. Bir pipet kullanarak bazal membran kubbesini yerinden çıkarın ve bir pipet ucu kullanarak bazal membran kubbesini ezin. Ayrışmış kubbe ve hücre geri kazanım solüsyonunu 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın.
4. 300 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı (hücre kurtarma çözeltisi) çıkarın. Tüm süpernatantları, son peletleme adımında organoidlerin varlığı onaylanana kadar sonuna kadar ayrı tüplerde saklayın.
6. İstenilen hacimde (Tablo 1) soğuk PBS ekleyin ve peleti mekanik olarak rahatsız etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
7. 300 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
8. Süpernatanı (PBS) çıkarın.
9. Peletleri, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %4 PFA'lık eşleşen bir hacimde (örneğin, 24 oyuklu plaka kültürü koşulundan bir pelet için 500 μL, Tablo 1) sabitleyin.
10. Fiksasyonu takiben, 300 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
11. Süpernatanı (PFA) çıkarın.
12. Eşleşen hacimde yıkayın (ör., 24 oyuklu plaka kültürü koşulundan bir pelet için 500 μL, Tablo 1) PBS ve 300 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
13. Sıcak agaroz hazırlayın (PBS'de% 2 agaroz).
    not: Burada, donmuş bölümler için hücre peletleri, 200 μL OCT bileşiği içinde doğrudan yeniden süspanse edilebilir.
14. Hücre peletini 200 μL agaroz (PBS'de% 2) içinde yeniden süspanse edin.
    1. Agaroz ekledikten hemen sonra, 1 mL şırıngaya bağlı 25 G'lik iğneyi kullanarak hücre peletini 1.5 mL'lik tüpün duvarından nazikçe ayırın. Şekil 1'de gösterildiği gibi, hücre peleti 1.5 mL'lik tüpün duvarından fiziksel olarak ayrılmazsa, agaroz gömme işlemi sırasında hücre peletinin tamamını veya bir kısmını kaybetme riski vardır.
15. PBS'deki %2'lik agaroz tamamen katılaşana kadar bekleyin.
16. 1 mL şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğne kullanarak katılaşmış agaroz bloğunu 1.5 mL'lik tüpten ayırın.
17. Hücre peletini içeren ayrılmış agaroz bloğunu 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
18. Tüpü% 70 EtOH ile doldurun ve doku dehidrasyonu ve parafin gömme için geleneksel protokolü kullanarak daha fazla ilerleyin.

Tablo 1: Bir kubbe için gereken tohumlama yoğunluğu, bazal membran hacmi ve orta hacim

Kültür Plakası	Tohumlama Yoğunluğu (hücreler)	Bazal Membran Hacmi (μL)	Orta (μL)
48 kuyu	25.000-50.000	20	250
24 kuyu	50.000-250.000	40	500
6 kuyu	50.000-250.000	40	2.000

Sonuçlar

Şekil 1: Başarılı agaroz gömme için önemli bir adım. Hücre peletini 1.5 mL'lik tüpün duvarından ayırmak için bir işlem.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL Pipet Aleti	Gilson	F123602
1 mL Şırınga	BD Şırınga	329654
1,5 mL tüp	Spectrum Lab Ürünleri	941-11326-ATP083
25G İğne	BD Hassas Kayma İğnesi	305122
%4 Paraformaldehit (PFA)	Alfa Aesar	J61899
%70 Etanol (EtOH)	VWR (VWR)	BDH1164-4LP
agaroz	Fransa	50000
Hücre Kültürü Plakası - 24 kuyu	Yardımcı yıldız	3524
Hücre Kültürü Plakası - 48 kuyu	Yardımcı yıldız	3548
Hücre Kültürü Plakası - 6 kuyulu	Yardımcı yıldız	3516
Hücre Ayrışma Çözümü, Accumax	Yenilikçi Hücre Teknolojileri A.Ş.	AM105
Hücre Geri Kazanım Çözeltisi	Corning	354253
Hücre Kazıyıcı	Sarstedt	83,18
dPBS (dPBS)	Corning/Cellgro	21-031-Özgeçmiş
1 mL için pipet uçları (Mavi Uçlar)	Balıkçı Markası Redi-İpucu	21-197-85
Küçük Masa Üstü Santrifüj	ThermoFisher Bilimsel	75002426
OCT Bileşiği	Doku-Tek	4583
Su Banyosu	Balıkçı Sc	2320

Serisi adet adet Serisi Belediyesi adet