Prostat Organoid Testi: Prostat Epitel Hücrelerinin Farklılaşma Kapasitesini İncelemek İçin Matris Jel Halka Bazlı Ex Vivo Kültür Tekniği

Özet

Kaynak: Crowell, P. D. et al. Organoid Kültür Kullanılarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Farklılaşma Kapasitesinin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, izole fare prostat epitel hücrelerinin matris jel halkası bazlı bir kültür tekniği kullanılarak kültürlenmesini gösteriyoruz. Bu yaklaşım, genetik veya farmakolojik manipülasyona yanıt olarak prostat epitel hücrelerinin 3D glandüler yapılar oluşturmak için farklılaşma kapasitesi hakkında tamamlayıcı bilgi sağlayabilir.

Protokol

1. Kaplama: Prostat Epitel Hücrelerini Birincil Fare Organoid Kültürüne Sıraladı — ZAMANLAMA: 2-3 H (Poli-HEMA kaplı plaka hazırlığı hariç)

NOT: Matris jelinin altındaki kuyu yüzeyinde 2D koloni oluşumunu önlemek için plakalar Poly-HEMA ile kaplanmıştır. Poli-HEMA kaplı plakaları, sıralanmış bazal veya luminal prostat epitel hücrelerini fare organoid kültürüne yerleştirmeden 1 gün önce hazırlayın. Bundan sonra matris jel olarak anılacak olan indirgenmiş büyüme faktörü matris jelinin 1 mL alikotlarını, adım 1.1'den 2 saat önce buz üzerinde çözdürün. Y-27632 (ROCK inhibitörü), adım 1.1'den hemen önce fare organoid ortamına eklenmelidir. Buz üzerinde 1.1-1.8 adımlarını gerçekleştirin.

1. Hücreleri 5 mL yuvarlak tabanlı tüplerde 800 x g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca pelet ve süpernatanı aspire edin.
2. Hücre peletini 500 μL fare organoid ortamında yıkayın (Tablo 1).
3. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile pelet yapın ve süpernatanı aspire edin.
4. Fare organoid ortamında 1.000 hücre / μL hücre yoğunluğunda yeniden süspansiyon yapın.
5. Ana karışımları hazırlamak için, fare organoid ortamında süspanse edilmiş epitel hücrelerini matris jel ile karıştırarak %25 hücre/ortam ve %75 matris jel içeren nihai bir karışım oluşturun. Bazal hücreler tipik olarak 100-2.000 hücre / 80 μL'lik bir konsantrasyonda kaplanırken, luminal hücreler tipik olarak 2.000-10.000 hücre / 80 μL'lik bir konsantrasyonda kaplanır. Kaplanan hücrelerin yoğunluğu, beklenen malzeme toplama gününe ve istenen sonraki uygulamaya bağlı olarak değişir.
   NOT: Ana karışımın hazırlanmasından 5 dakika önce beklenen ana karışım hacmi için uygun boyuttaki tüp(ler)i soğutun. Matris jelin kullanım sırasında sertleşmemesini sağlamak için, matris jeli yeni bir tüpe aktarmadan önce 3-4 kez pipetleyerek pipet ucunu soğutmak çok önemlidir.
6. 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 80 μL matris jel/hücre karışımı ekleyin. Poly-HEMA kaplama ile doğrudan temastan kaçınırken, kuyu duvarının alt yarısına bir damlacık pipetlenmesi önerilir. Matris jeli ekledikten sonra, matris jel/hücre karışımının kuyu kenarı etrafında bir halka oluşturmasına izin vermek için plakayı döndürün.
7. Matris jelin kısmen sertleşmesini sağlamak için 24 oyuklu plakayı 37 °C %5 CO₂ inkübatörüne sağ tarafı yukarı bakacak şekilde 10 dakika boyunca yerleştirin.
   NOT: 24 oyuklu plakayı inkübatöre yerleştirdikten hemen sonra fare organoid ortamını 37 °C'de ısıtmaya başlayın.
8. 10 dakika inkübe ettikten sonra, 24 oyuklu plakayı ters çevirin ve matris jelinin tamamen sertleşmesini sağlamak için 50 dakika daha inkübe edin.
9. Her kuyucuğun ortasına damla damla 350 μL önceden ısıtılmış fare organoid ortamı ekleyin.
   NOT: Matris jelin bütünlüğünü korumak için, ortam eklerken matris jel halkasından kaçınmak çok önemlidir.
10. Ortamı ekledikten sonra, 24 oyuklu plakayı 37 °C %5_CO2 inkübatöre geri koyun.

2. Fare Organoid Ortamının Yenilenmesi — ZAMANLAMA: 24 Kuyulu Plaka Başına 10-15 Dakika

NOT: Mevcut ortam her 48 saatte bir yeni ortamla değiştirilmelidir. Her ortam değişikliğinden önce, fare organoid ortamını önceden ısıtın. Yenileme için kullanılan ortama ROCK inhibitörü eklemek gerekli değildir.

1. 24 oyuklu plakayı 45° açıyla eğin ve matris jel halkasından kaçınırken bir P1000 pipeti kullanarak mevcut ortamı her bir oyuğun ortasından nazikçe çıkarın.
2. Adım 1.9'daki gibi 350 μL önceden ısıtılmış fare organoid ortamı ekleyin. Temel besin maddelerinin ve büyüme faktörlerinin hızlı tükenmesini önlemek için 5 günden daha uzun süre kültürlenen organoidlere daha büyük hacimde (1 mL'ye kadar) eklenmesi önerilir.

Tablo 1: Fare organoid ortamının hazırlanması için talimatlar

Serisi

parça	konsantrasyon
B-27 Uzay Aracı	1x (50x konsantreden seyreltin)
GlutaMAX	1x (100x konsantreden seyreltin)
N-asetil-L-sistein	1,25 milyon
Normosin	50 μg/mL
Rekombinant İnsan EGF, Hayvansız	50 ng/mL
Rekombinant İnsan Noggin	100 ng/mL
R-spondin 1 şartlandırılmış ortam	%10 şartlandırılmış medya
A83-01	200 deniz mili
DHT (DHT)	1 milyon
Y-27632 dihidroklorür (ROCK inhibitörü)	10 μM
Gelişmiş DMEM/F-12	Temel medya
R-spondin 1 koşullu ortam, Drost ve ark. Tüm bileşenlerin eklenmesinden sonra, filtre 0.22 μm filtre kullanarak fare organoid ortamını sterilize eder. ROCK inhibitörü sadece kültürün kurulması ve organoidlerin geçirilmesi sırasında eklenir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Sigma	F8667 Serisi
B-27 takviyesi (50x), serumsuz	Thermo Fisher Bilimsel	17504044
Gelişmiş DMEM/F-12	Thermo Fisher Bilimsel	12634010
μ Çanak 35 mm, yüksek	İbidi	81156
Matrigel GFR Membran Matrisi	Corning	CB-40230C
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)	Thermo Fisher Bilimsel	15-140-122
Poli (2-hidroksietil metakrilat) (Poli-HEMA)	Sigma	P3932-25G
Y-27632 dihidroklorür (ROCK inhibitörü)	Selleck Kimyasal	S1049-50MG
A83-01	Tocris (Türkçe)	2939
(DiHydro) testosteron (5αAndrostan-17β-ol-3-on)	Sigma	A-8380
GlutaMAX	Thermo Fisher Bilimsel	35050061
Normosin	Thermo Fisher Bilimsel	karınca-NR-1
Rekombinant İnsan EGF, Hayvansız	PeproTech Teknolojisi	AF-100-15
Rekombinant İnsan Noggin	PeproTech Teknolojisi	120-10C
RPMI 1640 Orta, HEPES (10 cs)	Thermo Fisher Bilimsel	22400105
Fosfataz İnhibitörünü Durdur	Thermo Fisher Bilimsel	78428
Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Sigma	11836145001
Triton X-100	Sigma	X100-5ML
Sonik Çözücü	Thermo Fisher Bilimsel	FB120

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi