Protein lizat ekstraksiyonu: hücresel proteinleri toplamak için organoidleri parçalamak için bir teknik

Özet

Kaynak: Crowell, P. D. et al. Organoid Kültür Kullanılarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Farklılaşma Kapasitesinin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, bir bazal membran matris halkasında kültürlenen prostat organoidlerinden protein lizatlarının ekstraksiyonunu gösteriyoruz. Ekstrakte edilen protein fraksiyonlarının analizi, organoidlerdeki soy işaretleyici ekspresyonunun incelenmesine yardımcı olabilir.

Protokol

1. Western Blot Analizi için Prostat Organoidlerinden Protein Lizatının Çıkarılması — ZAMANLAMA: 2.5-4 H

NOT: Protein lizat ekstraksiyonu için organoidleri toplamadan önce, dispas içeren ortamları hazırlayın ve önceden ısıtın (Tablo 1).

1. 24 oyuklu plakayı 45°'lik bir açıyla eğerek ve matris jel halkasından kaçınırken bir P1000 pipeti kullanarak mevcut ortamı her bir oyuğun ortasından nazikçe çıkararak ortamı her bir kuyucuktan çıkarın.
2. Organoidleri toplamak için, 1 mL dispas içeren ortamı tüm halka yerinden çıkana kadar doğrudan matris jel halkasına pipetleyerek matris jeli tekrar tekrar püskürtün ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: Poly-HEMA kaplı kuyucuklarla doğrudan temastan kaçınmak çok önemlidir. Doğrudan temas, toplanan materyalin Poly-HEMA ile kontaminasyonuna neden olabilir ve bu da hücre sağkalımını olumsuz etkileyebilir.
3. 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerini 37 ° C% 5 CO₂ inkübatörüne 30 dakika ila 1 saat boyunca yerleştirin, böylece matris jelinin dispas yoluyla tamamen sindirilmesini sağlayın.
4. RT'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme yoluyla organoidleri peletleyin ve süpernatanı bir mikropipet kullanarak çıkarın.
5. Organoid peletine fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve hafifçe hafifçe vurarak yeniden süspanse edin.
   NOT: Organoid peletin yeterince yeniden süspanse edilmemesi, organoid materyalin artık dispas veya matris jeli ile kontaminasyonuna neden olabilir.
6. Organoidleri RT'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı bir mikropipet kullanarak çıkarın.
7. Her bir tüpü kuru buz ve metanol içeren bir çözeltiye yerleştirerek organoid peletleri hızlı bir şekilde dondurun. Tüp(ler)i -80 °C'de ileride kullanılana kadar saklayın. Alternatif olarak, adım 1.6'dan hemen sonra protein lizatını çıkarın.
8. Organoid peletleri, 10 μL paketlenmiş hücre hacmi başına 100 μL protein lizis tamponunda (Tablo 1) yeniden süspanse edin. Yeniden askıya almak için hafifçe vurun.
   NOT: Hızlı dondurmadan sonra devam ediyorsa, numuneleri -80 °C'den çıkarmadan önce protein lizis tamponunun çözüldüğünden emin olun, çünkü fosfataz ve proteaz aktivitesini önlemek için numunelere hemen lizis tamponu eklenmelidir.
9. Numuneleri buz üzerinde protein lizis tamponunda en az 45 dakika inkübe edin.
   NOT: Nükleer protein geri kazanımının verimliliğini artırmak için buz üzerinde inkübasyondan önce sonikasyon yapılması önerilir; Ancak, sonikasyon gerekli değildir. Sonikasyon yapılmazsa, adım 1.10'a geçin.
   1. Sonikasyon yapmak için, tüpleri ıslak buza batırın ve sonik çözücünün ucunu mikrosantrifüj tüpüne nazikçe uygulayın. 20 kHz'de 40 saniye boyunca sonikate.
10. Yerleşik protokolleri takip ederek Western blot'a ilerleyin.

Tablo 1: Anahtar çözümlerin hazırlanması için talimatlar

Tarifler
Dispase içeren medya	İleri DMEM F12'de 1 mg / mL dispas + 10 μM ROCK inhibitörü. Filtre, 0.22 μm filtre kullanarak sterilize edilir.
Ayrışma ortamı	RPMI 1640'ta% 10 FBS + 1x Penisilin-Streptomisin. Filtre, 0.22 μm filtre kullanarak sterilize edilir.
Protein lizis tamponu	RIPA tamponu + fosfataz inhibitörleri + proteaz inhibitörleri
Engelleme çözümü	%0.2 Triton X-100 ile PBS'de %10 FBS

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
A83-01	Tocris (Türkçe)	2939
Gelişmiş DMEM/F-12	Thermo Fisher Bilimsel	12634010
B-27 takviyesi (50x), serumsuz	Thermo Fisher Bilimsel	17504044
Dispase II, Toz	Thermo Fisher Bilimsel	17-105-041
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Sigma	F8667 Serisi
GlutaMAX Termo	Balıkçı Bilimsel	35050061
Fosfataz İnhibitörünü Durdur	Thermo Fisher Bilimsel	78428
Matrigel GFR Membran Matrisi	Corning CB-	40230C
N-asetil-L-sistein	Sigma	A9165
Normosin	Thermo Fisher Bilimsel	karınca-NR-1
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ mL)	Thermo Fisher Bilimsel	15-140-122
Poli (2-hidroksietil metakrilat) (Poli-HEMA)	Sigma	P3932-25G
Radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA)	Thermo Fisher Bilimsel	PI89901
Rekombinant İnsan EGF, AnimalFree	PeproTech Teknolojisi	AF-100-15
Rekombinant İnsan Noggin	PeproTech Teknolojisi	120-10C
RPMI 1640 Orta, HEPES (cs of 10)	Thermo Fisher Bilimsel	22400105
Sonik Çözücü	Thermo Fisher Bilimsel	FB120
Triton X-100	Sigma	X100-5ML
Y-27632 dihidroklorür (ROCK inhibitörü)	Selleck Kimyasal	S1049-50MG

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi