Tam Montajlı İmmünofloresan Görüntüleme: Sağlam Organoidleri Değerlendirmek İçin Bir Sabitleme ve Boyama Tekniği

Özet

Kaynak: Crowell, P. D. et al. Organoid Kültür Kullanılarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Farklılaşma Kapasitesinin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, sağlam prostat kanseri organoidlerinin immünofloresan boyama tekniği ve bunların tam montajlı konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi açıklanmaktadır. Bu teknik, bazal ve luminal prostat epitel hücrelerinin ex vivo farklılaşma kapasitesini değerlendirmeyi amaçlar.

Protokol

1. Tam Montajlı Konfokal Mikroskopi ile İmmünohistokimyasal Analiz için Prostat Organoidlerinin Sabitlenmesi ve Boyanması

1. 24 oyuklu plakalardan prostat organoidlerinin toplanması — ZAMANLAMA: 45-60 dk
   NOT: Konfokal mikroskopi için işlem yapmak üzere prostat organoidlerini toplarken, yapılarını korumak için bunları dikkatli bir şekilde kullanmak çok önemlidir. Aşağıdaki toplama protokolü, izolasyon sırasında organoid yapının bozulmasını azaltmak için tasarlanmıştır.
   1. Plakayı 45°'lik bir açıyla eğerek organoidler içeren plakanın her bir oyuğundan ortamı çıkarın.
   2. Matris jeli, 37 ° C% 5 CO₂

Sonuçlar

Şekil 1: Prostat organoidlerinde soy belirteç ekspresyonunun Western blot ve tam montajlı konfokal mikroskopi ile analizi.(A) 7 günlük kültürden sonra bazal kaynaklı (üstte) ve luminal türevli (altta) organoidlerin temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) 5 günlük kültürden sonra bazal kaynaklı (Bas) ve luminal kaynaklı (Lum) organoidlerin Western .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 16 Paraformaldehit	Thermo Fisher Bilimsel	50-980-487
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher Bilimsel	D1306
Gelişmiş DMEM/F-12	Thermo Fisher Bilimsel	12634010
Dispase II, Toz	Thermo Fisher Bilimsel	17-105-041
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Sigma	F8667 Serisi
Keçi anti-fare IgG-Alexa Fluor 488	Canlandırıcı	A28175
Keçi anti-tavşan IgG-Alexa Fluor 594	Canlandırıcı	A11012
Fare anti-sitokeratin 8	Biyo Efsane	904804
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL)	Thermo Fisher Bilimsel	15-140-122
Tavşan anti-p63	Biyo Efsane	619002
RPMI 1640 Orta, HEPES (10 cs)	Thermo Fisher Bilimsel	22400105
Sakaroz	Sigma	S0389-500G
Triton X-100	Sigma	X100-5ML

Serisi Serisi Serisi Serisi