Tam Montajlı İmmünofloresan Görüntüleme: Sağlam Organoidleri Değerlendirmek İçin Bir Sabitleme ve Boyama Tekniği

1. Tam Montajlı Konfokal Mikroskopi ile İmmünohistokimyasal Analiz için Prostat Organoidlerinin Sabitlenmesi ve Boyanması

1. 24 oyuklu plakalardan prostat organoidlerinin toplanması — ZAMANLAMA: 45-60 dk
   NOT: Konfokal mikroskopi için işlem yapmak üzere prostat organoidlerini toplarken, yapılarını korumak için bunları dikkatli bir şekilde kullanmak çok önemlidir. Aşağıdaki toplama protokolü, izolasyon sırasında organoid yapının bozulmasını azaltmak için tasarlanmıştır.
   1. Plakayı 45°'lik bir açıyla eğerek organoidler içeren plakanın her bir oyuğundan ortamı çıkarın.
   2. Matris jeli, 37 ° C% 5 CO₂ inkübatörde 30 dakika boyunca 500 μL dispas içeren ortam (Tablo 1) ile inkübe ederek sindirin.
   3. Sindirilmiş organoid süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
2. Prostat organoidlerinin tam montajlı immünofloresan boyaması — ZAMANLAMA: 3-4 gün (1-5 saat / gün)
   1. PBS'ye 500 μL% 4 paraformaldehit ekleyin ve hafifçe çalkalayarak RT'de 2 saat inkübe edin.
   2. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL PBS ile 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
   3. Peleti adım 1.2.2'deki gibi iki kez daha yıkayın.
   4. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Bloke edici çözeltiye 1 μg / mL DAPI ekleyin (Tablo 1). RT'de 2 saat veya alternatif olarak gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
   5. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Bloke edici solüsyona birincil antikor (tavşan anti-p63, fare anti-sitokeratin 8) ekleyin ve hafifçe çalkalama ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   6. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Peletleri 1 mL PBS ile 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
   7. Peleti adım 1.2.6'daki gibi iki kez daha yıkayın.
   8. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Bloke edici çözeltiye ikincil antikor (keçi tavşan önleyici IgG-Alexa Fluor 594, keçi anti-fare IgG-Alexa Fluor 488) ekleyin ve hafifçe çalkalama ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   9. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL PBS ile 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
   10. Peletleri adım 1.2.9'daki gibi iki kez daha yıkayın.

2. Tam Montajlı Konfokal Mikroskopi için Lekeli Prostat Organoidlerinin Doku Temizleme ve Montajı — ZAMANLAMA: 7 SAAT

1. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın.
2. % 1 Triton X-100 ile PBS'ye 1 mL% 30 sükroz ekleyin ve hafifçe çalkalama ile RT'de 2 saat inkübe edin.
3. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın.
4. % 1 Triton X-100 ile PBS'ye 1 mL% 45 sükroz ekleyin ve hafifçe çalkalayarak RT'de 2 saat inkübe edin.
5. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın.
6. % 1 Triton X-100 ile PBS'ye 1 mL% 60 sükroz ekleyin ve hafifçe çalkalayarak RT'de 2 saat inkübe edin.
7. Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatantın %95'ini çıkarın.
   NOT: Sükroz konsantrasyonu arttıkça pelet gevşer. Süpernatantın çıkarılması sırasında kaybolmadıklarını doğrulamak için DAPI lekeli organoidlerin UV ışığı altında gözlemlenmesi önerilir.
8. Kalan süspansiyonun 10-20 μL'lik bir damlacığını odacıklı bir lamel üzerine aktarın ve konfokal mikroskobuğa devam edin.
   NOT: Lamel parçaları, ara parça olarak kullanılmak üzere damlalığın her iki tarafına da yerleştirilebilir (Şekil 1C). Bunlar, damlacık üzerine bir lamel yerleştirildiğinde organoidlerin çökmesini önler.

Tablo 1: Anahtar çözümlerin hazırlanması için talimatlar

Şekil 1: Prostat organoidlerinde soy belirteç ekspresyonunun Western blot ve tam montajlı konfokal mikroskopi ile analizi.(A) 7 günlük kültürden sonra bazal kaynaklı (üstte) ve luminal türevli (altta) organoidlerin temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) 5 günlük kültürden sonra bazal kaynaklı (Bas) ve luminal kaynaklı (Lum) organoidlerin Western blot analizi. Bazal işaretleyici, sitokeratin 5 (K5) ve lümen belirteci, sitokeratin 8 (K8) ve bir yükleme kontrolü, histon H3 (HH3) için boyama. (C) Ara parçalı odacıklı lamel gösteren şematik. (D) 7 günlük kültürden sonra bazal kaynaklı (üstte) ve luminal kaynaklı (altta) organoidlerin temsili diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve immünofloresan görüntüleri. P63 (kırmızı), K8 (yeşil) ve DAPI (mavi) için ayrı ayrı ve birleştirilmiş boyama. Ölçek çubukları = 100 μm.