$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Tam Montajlı Konfokal Mikroskopi ile İmmünohistokimyasal Analiz için Prostat Organoidlerinin Sabitlenmesi ve Boyanması
- 24 oyuklu plakalardan prostat organoidlerinin toplanması — ZAMANLAMA: 45-60 dk
NOT: Konfokal mikroskopi için işlem yapmak üzere prostat organoidlerini toplarken, yapılarını korumak için bunları dikkatli bir şekilde kullanmak çok önemlidir. Aşağıdaki toplama protokolü, izolasyon sırasında organoid yapının bozulmasını azaltmak için tasarlanmıştır.
- Plakayı 45°'lik bir açıyla eğerek organoidler içeren plakanın her bir oyuğundan ortamı çıkarın.
- Matris jeli, 37 ° C% 5 CO2 inkübatörde 30 dakika boyunca 500 μL dispas içeren ortam (Tablo 1) ile inkübe ederek sindirin.
- Sindirilmiş organoid süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
- Prostat organoidlerinin tam montajlı immünofloresan boyaması — ZAMANLAMA: 3-4 gün (1-5 saat / gün)
- PBS'ye 500 μL% 4 paraformaldehit ekleyin ve hafifçe çalkalayarak RT'de 2 saat inkübe edin.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL PBS ile 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
- Peleti adım 1.2.2'deki gibi iki kez daha yıkayın.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Bloke edici çözeltiye 1 μg / mL DAPI ekleyin (Tablo 1). RT'de 2 saat veya alternatif olarak gece boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Bloke edici solüsyona birincil antikor (tavşan anti-p63, fare anti-sitokeratin 8) ekleyin ve hafifçe çalkalama ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Peletleri 1 mL PBS ile 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
- Peleti adım 1.2.6'daki gibi iki kez daha yıkayın.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın. Bloke edici çözeltiye ikincil antikor (keçi tavşan önleyici IgG-Alexa Fluor 594, keçi anti-fare IgG-Alexa Fluor 488) ekleyin ve hafifçe çalkalama ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin, süpernatanı çıkarın ve peleti 1 mL PBS ile 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
- Peletleri adım 1.2.9'daki gibi iki kez daha yıkayın.
2. Tam Montajlı Konfokal Mikroskopi için Lekeli Prostat Organoidlerinin Doku Temizleme ve Montajı — ZAMANLAMA: 7 SAAT
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın.
- % 1 Triton X-100 ile PBS'ye 1 mL% 30 sükroz ekleyin ve hafifçe çalkalama ile RT'de 2 saat inkübe edin.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın.
- % 1 Triton X-100 ile PBS'ye 1 mL% 45 sükroz ekleyin ve hafifçe çalkalayarak RT'de 2 saat inkübe edin.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı çıkarın.
- % 1 Triton X-100 ile PBS'ye 1 mL% 60 sükroz ekleyin ve hafifçe çalkalayarak RT'de 2 saat inkübe edin.
- Organoidleri RT'de 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatantın %95'ini çıkarın.
NOT: Sükroz konsantrasyonu arttıkça pelet gevşer. Süpernatantın çıkarılması sırasında kaybolmadıklarını doğrulamak için DAPI lekeli organoidlerin UV ışığı altında gözlemlenmesi önerilir.
- Kalan süspansiyonun 10-20 μL'lik bir damlacığını odacıklı bir lamel üzerine aktarın ve konfokal mikroskobuğa devam edin.
NOT: Lamel parçaları, ara parça olarak kullanılmak üzere damlalığın her iki tarafına da yerleştirilebilir (Şekil 1C). Bunlar, damlacık üzerine bir lamel yerleştirildiğinde organoidlerin çökmesini önler.
Tablo 1: Anahtar çözümlerin hazırlanması için talimatlar
Serisi
| parça | konsantrasyon |
| B-27 Uzay Aracı | 1x (50x konsantreden seyreltin) |
| GlutaMAX | 1x (100x konsantreden seyreltin) |
| N-asetil-L-sistein | 1,25 milyon |
| Normosin | 50 μg/mL |
| Rekombinant İnsan EGF, Hayvansız | 50 ng/mL |
| Rekombinant İnsan Noggin | 100 ng/mL |
| R-spondin 1 şartlandırılmış ortam | %10 şartlandırılmış medya |
| A83-01 | 200 deniz mili |
| DHT (DHT) | 1 milyon |
| Y-27632 dihidroklorür (ROCK inhibitörü) | 10 μM |
| Gelişmiş DMEM/F-12 | Temel medya |
| R-spondin 1 koşullu ortam, Drost, et al.'de tarif edildiği gibi üretilir. Tüm bileşenlerin eklenmesinden sonra, filtre 0.22 μm filtre kullanarak fare organoid ortamını sterilize eder. ROCK inhibitörü sadece kültürün kurulması ve organoidlerin geçirilmesi sırasında eklenir. |
