Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
2.8K görüntülenme
⸱
30 Nisan 2023
Kaynak: Chen S. et al. Tek Hücreli Alt Akış Karakterizasyonu için Hedef Hücre Ön Zenginleştirme ve Tüm Genom Amplifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)
Bu videoda, periferik kan örneklerinden EpCAM eksprese eden epitel kanseri hücrelerinin izolasyonunu gösteriyoruz. Teknik, hedef hücreleri yakalamak için EpCAM antikorları ile işlevselleştirilmiş tıbbi sınıf bir telin kullanılmasını içerir. Yakalanan hücreler daha sonra bir tampon çözeltiye ekstrakte edilir.
>NOT: Bu protokol, HT-29 hücrelerinin (insan kolon kanseri hücre hattı) PBS'den veya HT-29 hücreleri ile periferik kanın yapay karışımlarından izolasyonunu tanımlar. Aynı deney iki ek hücre hattı (LNCaP ve VCaP) ile gerçekleştirildi ve teorik olarak EpCAM eksprese eden tüm hücrelerle gerçekleştirilebilir.
>1. Hedef Hücrelerin Hazırlanması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Şekil 1: Etiketli hücreleri görselleştirme.(A,E) Şarj etmeden önce hücreler: Hücreler CFSE ile etiketlenir ve bir dizi CFSE (yeşil) sinyal yoğunluğu gösteren bir DNA ara tabaka boyası ile karşı boyanır. (B,F) Tel üzerinde yakalanan etiketli hücreler. (C,G) Hücre ayırma işleminden sonra tel. (D.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Gilupi Serbest Bırakma Tamponu | Gilupi Dili | GIL083 Serisi | Hücreleri telden ayırmak için kullanılır |
| McCoy's 5A Orta (1x) takviye L-Glutamin ile | Thermo Fisher Bilimsel | 16600-082 | HT-29 hücreleri için kullanılan kültür ortamı, deneyler için kullanılan kültür ortamını hücre hattına uyarlar |
| HEPES Tampon Çözeltisi (1 M) | PAA (Türkçe) | S11-001 Serisi | McCoy's 5A Medium için ek |
| Fetal Sığır Serumu Altın | PAA (Türkçe) | A15-151 | McCoy's 5a Modifiye Ortamı için Ek |
| Penisilin-Streptomisin (100x) | Biyobatı | L0018-100 | McCoy's 5a Modifiye Ortamı için Ek |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x PBS) | Thermo Fisher Bilimsel | 10010-015 | |
| Aktataz | Biyobatı | L0950-100 | Hücre ayrılma çözeltisi (hücre kültürü) |
| Su banyosu | GFL (Cesaret Numarası | 1003 yazın | Ön ısıtma çözeltileri için kullanılır |
| kuvöz | Thermo Fisher Bilimsel | Hücreleri inkübe etmek için kullanılır (hücre kültürü) | |
| 50 mL reaksiyon tüpleri | VWR (VWR) | 525-0403 | |
| Silindirli karıştırıcı | Stuart Bilimsel | SRT6D | Hücrelerin çökelmesini önlerken hücreleri tele bağlamak için kullanılır |
| CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon Kiti | Thermo Fisher Bilimsel | C34554 | Canlı hücreleri etiketlemek için kullanılır (sitoplazmik etiket) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Bilimsel | DNA'yı boyamak için kullanılır (nükleik karşı leke) |
| Santrifüj (15 mL ve 50 mL reaksiyon tüplerini tutmak için donatılmıştır) | Thermo Fisher Bilimsel | Heraeus Megafüj 40R | Hücreleri peletlemek için kullanılır |
| Observer Z1 (Floresan/lazer mikrodiseksiyon mikroskobu) | Carl Zeiss Mikro Görüntüleme | Lazer mikrodiseksiyon yapabilen ters (immünofloresan) mikroskop; Floresan mikroskopları Hoechst 33342 (DAPI filtresi) ve CFSE'yi (FITC filtresi) algılayabilmelidir | |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Cam/plastik yüzeyleri kaplamak için kullanılır |
| MS1 Mini Çalkalayıcı | Sigma-Aldrich | Z404039 | Girdap için kullanılır |
| Vacutainer EDTA (veya Na-heparin) tüpleri | Bd | 366450 (veya 366480) | Hedef hücrelerin ex vivo yakalanması için reaksiyon tüpü olarak kullanılır |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi Dili | GIL003 Serisi | EpCAM pozitif hücreleri izole edebilen ve ayırabilen işlevselleştirilmiş tel (yakala ve bırak, C&R olarak da adlandırılır) |
| Şırınga iğneleri (G20) | VWR (VWR) | 613-0554 | C&R'nin işlevsel olmayan kısmının içinden geçmesine izin vermek için lastik kapakları delmek için kullanılır |
| Neubauer odası | Roth | T729.1 Serisi | Hücreleri saymak için kullanılır |
| Pastör pipetleri 150 mm | Volac Belediyesi | D810 | Hücrelerin C&R'ye düşük hacimli uygulanması için kullanılır |
| Yağlı kalem | Dako Belediyesi | S2002 Serisi | Hücre süspansiyonunu yerinde tutmak için cam kızaklarda kullanılır |
| Steril şırınga filtresi (0,2 μm) | Corning | 431219 | Taze hazırlanmış Gilupi Release Buffer'ı filtrelemek için |
| Delfia Plaka Çalkalayıcı | Perkin Elmer | 1296-003 | Hücre ayrılması sırasında ajitasyon için kullanılır |
| 1,5 mL tüpler | Eppendorf Belediyesi | 30.125.150 | |
| Ampli1 WGA Takımı | Silikon Biyosistemler | Silicon Biosystems üzerinden sipariş verilecek | |
| Axiovert M200, Mikromanipülatör MMJ ve CellTram vario ile donatılmıştır | Zeiss/Eppendorf | Eldeki mikromanipülasyonu kullanın | |
| Mikrokılcal damarlar (25 μm çapında), CustomTip I | Eppendorf Belediyesi | 930001201 | Hücreleri mikromanipüle etmek için kullanılır |
| 0.2 mL PCR tüpleri | Biyozym | 710920 | |
| Sitosantrifüj ve ekipmanları | Hettich | Evrensel 32 | Elinizde sitosantrifüj kullanın |
| Termo döngüleyici | Biyo-Rad | DNA Motor Dyad | Isıtmalı kapaklı her termo döngüleyici kullanılabilir |
| Mikrosantrifüj | Roth | CX73.1 | Elinizin altında masa üstü santrifüj kullanın |
| Membran Kaydırağı 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Lazer mikrodiseksiyon için kullanılan membran kaplı cam slaytlar |
