İşlevselleştirilmiş Tel Tabanlı Hedef Hücre İzolasyonu: Kanser Hücrelerini Çivili Periferik Kandan İzole Etmek İçin Bir Ex Vivo Teknik

Özet

Kaynak: Chen S. et al. Tek Hücreli Alt Akış Karakterizasyonu için Hedef Hücre Ön Zenginleştirme ve Tüm Genom Amplifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, periferik kan örneklerinden EpCAM eksprese eden epitel kanseri hücrelerinin izolasyonunu gösteriyoruz. Teknik, hedef hücreleri yakalamak için EpCAM antikorları ile işlevselleştirilmiş tıbbi sınıf bir telin kullanılmasını içerir. Yakalanan hücreler daha sonra bir tampon çözeltiye ekstrakte edilir.

Protokol

>NOT: Bu protokol, HT-29 hücrelerinin (insan kolon kanseri hücre hattı) PBS'den veya HT-29 hücreleri ile periferik kanın yapay karışımlarından izolasyonunu tanımlar. Aynı deney iki ek hücre hattı (LNCaP ve VCaP) ile gerçekleştirildi ve teorik olarak EpCAM eksprese eden tüm hücrelerle gerçekleştirilebilir.

>1. Hedef Hücrelerin Hazırlanması

1. Hücre kültürü ve hücrelerin etiketlenmesi
   not: Bu protokolde hücreler 75 cm²'lik kültür şişelerinde kültüre edilir. Diğer hücre kültürü cihazları kullanılıyorsa (örneğin, 25 cm² kültür kapları, 6 oyuklu plakalar, vb.) lütfen reaktif miktarlarını buna göre ayarlayın. Kullanılan tüm sıvılar bir su banyosunda 37 °C'ye kadar önceden ısıtılır. Aksi belirtilmedikçe, tüm protokol adımları oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir.
   1. % 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de 2 mM L-glutamin, 20 mM Hemes,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş McCoy'un 5a Modifiye Ortamındaki HT-29 hücrelerinin kültürü.
   2. Hücreler% 90 birleştiğinde, ortamı çıkarın ve hücreleri 10 mL 1x PBS ile durulayın.
   3. Hücreleri hasat etmek için, hücrelere 2 mL hücre ayırma çözeltisi (Malzeme ve Reaktif Tablosu) ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de yaklaşık 5 dakika inkübe edin.
      not: Ayırma çözeltisi, 1x PBS, 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 3 mg/L fenol kırmızısında proteolitik ve kollajenolitik enzimler içerir. Hücre ayırma çözeltisinin ön ısıtma süresini minimuma indirin, çünkü bu, 37 ° C'de 1 saat sonra devre dışı kalacaktır. Optimum hücre ayrılmasını elde etmek için tüm hücre katmanını kaplayın.
   4. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak hücrelerin ayrılmasını kontrol edin.
   5. Ayrılan tüm hücreleri, 10 mL hücre kültürü ortamı (adım 1.1.1'de kullanılanla aynı) ile önceden doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri pipetleme yoluyla yeniden süspanse edin.
   6. Kalan hücre süspansiyonunu RT'de yatay bir silindirli karıştırıcıya yerleştirin ve etiketleme adımına geçin.
2. Hedef hücrelerin canlı hücre etiketlemesi
   1. 5 μM kullanıma hazır CFSE etiketleme çözeltisini elde etmek için 1 μL 5 mM CFSE'yi (dimetil sülfoksit, DMSO içinde verilir) 37 °C'de önceden ısıtılmış 1 mL 1x PBS içinde seyreltin.
      not: Optimum boyama sonuçları için taze hazırlanmış solüsyonlar kullanın.
   2. 1x PBS'de kullanıma hazır bir DNA boyama solüsyonu (Malzeme ve Reaktifler Tablosu) hazırlayın ve ışıktan koruyarak 2-6 °C'de saklayın.
      not: Optimum boyama sonuçları için taze hazırlanmış solüsyonlar kullanın.
   3. Hücreleri yatay silindirli karıştırıcıdan alın (adım 1.1.6.) ve hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 10 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
   4. Hücreleri 1x PBS ile tekrar durulayın ve hücre peletini 500 μL'lik kullanıma hazır bir CFSE etiketleme solüsyonunda yeniden süspanse edin.
   5. Hücreleri 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin ve santrifüjlemeden sonra hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g'da toplayın.
   6. Etiketli hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve hücrelerin 37 ° C'de 30 dakika boyunca yenilenmesine izin verin.
   7. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile hasat edin ve hücre peletlerini 1 mL kullanıma hazır DNA boyama solüsyonunda 37 ° C'de 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin.
   8. Hücreleri peletleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 4 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu değerlendirin ve 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ve floresein izotiyosiyanat (FITC) filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak floresan etiketlemesini kontrol edin (Şekil 1A ve 1E).
   9. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve bir sonraki bölümde verildiği gibi ilgili deney için gereken hücre yoğunluklarına göre hücre peletini yeniden süspanse edin ve buzun üzerine yerleştirin.

2. Kabloyu Şarj Etme

NOT: Hücreler, mililitre ölçeğinde veya mikrolitre ölçeğinde düşük sayıda hücre sağlanarak hedef hücre/periferik kan sıçramalarından izole edilebilir. İlk yaklaşım, periferik kandaki nadir hücre koşullarını taklit etmeye izin verirken, ikincisi, protokol optimizasyonu / testi amacıyla birkaç hücreyi bağlamak için tercih edilen yol olabilir.

1. Kabloyu büyük miktarda hücre süspansiyonu kullanarak şarj etme
   1. 0.8 g BSA'yı 40 mL 1x PBS'de (hücre kültürü kullanımı) çözerek %2'lik bir BSA bloke etme çözeltisi hazırlayın. BSA'yı ilk girdaplama ve ardından RT'de 10-20 dakika boyunca yatay silindirli bir karıştırıcıda inkübasyon ile çözün.
   2. Antikoagülan kalıntılarını gidermek için boş EDTA tüplerini / sodyum heparin tüplerini 2 mL% 2 BSA ile durulayın ve çözeltiyi atın. Tüp yüzeyini, 30 dakika boyunca 15 rpm'de yatay silindirli bir karıştırıcı üzerinde 5 mL% 2 BSA ile RT'de inkübe ederek bloke edin ve çözeltiyi atın.
   3. Etiketli hücreleri (bölüm 1.2.) 100.000 hücre/mL yoğunluğa seyreltin ve teli şarj etmek için 5 mL kullanın.
   4. Tüpe 5 mL etiketli hücre süspansiyonu (toplamda 500.000 hücre) ekleyin. Hücre süspansiyonunu eklerken kabarcıklardan kaçının.
   5. Kabloyu saklama bölmesinden ve teli tutan lastik kapaktan çıkarın ve 1x PBS'de durulayın (Şekil 2).
   6. Bir şırınga iğnesi (20 G) yardımıyla EDTA tüpünün kauçuk tüp kapağına (adım 2.1.4.) nüfuz edin ve eli, kapak tüpün üzerine geri döndüğünde fonksiyonel parça hücre süspansiyonuna tamamen daldırılacak ve tüp eğimli silindir karıştırıcı üzerine yerleştirilecek şekilde yerleştirin.
      not: Telin üçlü sarmal fonksiyonel kısmı, şarj boyunca hücre süspansiyonu ile kaplanmalıdır.
   7. Hücrelerin tele yapışmasını sağlamak için tüpleri eğimli bir silindir karıştırıcı üzerinde 5 rpm'de 30 dakika döndürün.
   8. Teli 5 mL 1x PBS ile durulayın ve karanlıkta 2-6 °C'de 1x PBS içeren 15 mL'lik bir tüpte görsel muayeneye kadar saklayın.
      not: Telin işlevsel kısmı, hücrelere zarar vermemek için her zaman PBS'ye daldırılmalıdır.
2. Hedef hücrelerin periferik kanla yapay karışımlardan izole edilmesi (alternatif şarj yöntemi: 2.1. Telin büyük miktarda hücre süspansiyonu kullanılarak şarj edilmesi)
   1. Yüksek hücre yoğunluğuna (1.000.000 hücre/mL'>) sahip hücre süspansiyonları elde etmek için etiketli hücreleri (bölüm 1.2.) seyreltin, böylece periferik kana eklenen hücre süspansiyonunun hacmini düşük tutun.
   2. 5 mL periferik kana 500 ila 500.000 hücre ekleyin ve tüpü ters çevirerek karıştırın.
   3. Kabloyu saklama bölmesinden çıkarın, teli tutan lastik kapağı çıkarın ve 1x PBS'de durulayın.
   4. Bir şırınga iğnesi (20 G) kullanarak cihazın işlevsel olmayan kısmı ile yeni bir tüp kapağına nüfuz edin, böylece kapak tüpün üzerine geri döndüğünde ve tüp eğimli silindirli karıştırıcının üzerine yerleştirildiğinde fonksiyonel kısım çivili kana tamamen daldırılır.
      not: Telin üçlü sarmal fonksiyonel kısmı, şarj boyunca hücre süspansiyonu ile kaplanmalıdır.
   5. Tüpü eğimli silindir karıştırıcı üzerinde RT'de 30 dakika boyunca 5 rpm'de inkübe edin.
   6. Teli 1x PBS'de üç kez durulayın ve görsel muayeneye kadar karanlıkta 1x PBS içeren 15 mL'lik bir tüpte saklayın.
      not: Hücrelere zarar vermemek için telin işlevsel kısmı her zaman suya batırılmalıdır.
3. Kablonun düşük hacimli hücre süspansiyonlarından şarj edilmesi (alternatif şarj yöntemi: 2.1. Telin büyük miktarda hücre süspansiyonu kullanılarak şarj edilmesi)
   1. Etiketli hücreleri 1x PBS'de 1.000.000 hücre / mL'de yeniden askıya alın.
   2. 150 mm'lik tek kullanımlık cam Pasteur pipetini bir rafa yatay olarak sabitleyin.
   3. Kabloyu saklama bölmesinden çıkarın, ancak teli tutan sarı lastik kapağı tutun.
   4. Teli, işlevsel kısım Pasteur pipetinin ucunda yer alacak ve cama değmeyecek şekilde pipete yerleştirin.
      not: Telin ucu Pasteur pipet ucundan dışarı çıkmamalıdır. Pasteur pipet ucunun arka ucunu teli tutan lastik kapakla tıkamaktan kaçının. Sıkıca takılırsa, hücre süspansiyonları diğer taraftan pipet ucuna yüklenemez.
   5. Telin işlevselleştirilmiş kısmını kaplayan Pasteur pipetinin ucuna 15 μL hücre süspansiyonu yükleyin.
   6. Teli 10 dakika inkübe edin. Monte edilmiş teli/Pasteur pipet ucunu her dakika manuel olarak çeyrek çevirin.
   7. Teli Pasteur pipet ucundan çıkarın, 5 mL 1x PBS içinde durulayın ve karanlıkta 2-6 °C'de 1x PBS içeren 15 mL'lik bir tüpte görsel muayeneye kadar saklayın.
      not: Hücrelere zarar vermemek için fonksiyonel parça her zaman 1x PBS'ye daldırılmalıdır.

>3. Teldeki Hücreleri Sayma

NOT: Hücrelere zarar vermemek için telin işlevsel kısmını her zaman 1x PBS'ye batırılmış halde tutun.

1. Bir cam slayt üzerine dikdörtgen bir alan çizmek için bir yağlı kalem kullanın ve 500 μL 1x PBS ekleyin.
2. Telin işlevsel olmayan kısmını bükün ve işlevsel parça 1x PBS.
   içine daldırılacak şekilde cam slayt üzerine yerleştirin not: Telin işlevsel kısmını tamamen kaplamak için dikdörtgenin alanını ve 1x PBS hacmini sığdırın. Telin işlevsel olmayan kısmını kızağa monte etmek için çift yüzlü bir yapışkan bant kullanın.
3. Yakalanan hücreleri numaralandırmak için telin her iki tarafını görsel olarak inceleyin (Şekil 1B ve 1F).
   not: Hücrelerin varlığı, DAPI ve FITC için filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak belirlenir. Telin her iki tarafı da incelenebilir ve hücre sayısı değerlendirilebilir (yüksek hücre sayıları için) veya sayılabilir (yalnızca tele az sayıda hücre bağlıysa uygulanabilir). Hücrelerin numaralandırılması gerekli değilse bu adım atlanabilir.
4. Taradıktan sonra, teli 1x PBS içeren 15 mL'lik tüpe geri yerleştirin, kabloyu karanlıkta saklayın.
   not: Telin işlevsel olmayan kısmının çoğu kesilebilir (bükülme dahil) ve çıkarılabilir, bu da depolamayı kolaylaştırır.

4. Hedef Hücrelerin Ayrılması ve Geri Kazanılması

NOT: Hücrelerin ayrılması, izolasyondan sonraki 4 saat içinde yapılmalıdır.

1. 1x PBS'nin mL'si başına 4 mg salım tamponu bileşenini (Malzeme ve Reaktifler Tablosu) çözün ve kullanıma hazır tamponu elde etmek için çözeltiyi 0.2 μm steril bir filtreden süzün.
   not: Telin polimeri, EpCAM sunan hedef hücrelere bağlanmaya izin veren anti-EpCAM antikorları ile işlevselleştirilmiş bir hidrojelden oluşur. Serbest bırakma tamponu, hidrojeli parçalayabilen bir karbon-oksijen proteolitik enzim içerir. Proteolitik bölünme, polimerin bozulmasına ve dolayısıyla yakalanan hücrelerin ayrılmasına neden olur.
2. Serbest bırakma tamponunu 37 °C'de 5 dakika önceden ısıtın.
3. 1.5 mL'lik bir reaksiyon tüpünü doldurmak için 1.6 mL serbest bırakma tamponu ekleyin.
   not: 1.5 mL reaksiyon hacimleri için tasarlanmış tüpler, telin fonksiyonel kısmını daldırmak için gerekli olan 1.6 mL'nin uygulanmasına izin verir.
4. Telin işlevsel kısmını serbest bırakma tamponunda 37 ° C'de (su banyosu) 20 dakika inkübe edin. Su banyosunda inkübasyon sırasında kontaminasyonu önlemek için teli 1.5 mL'lik tüpe sabitlemek için tüp kapağı yerine tel ile birlikte verilen lastik kapağı kullanın.
5. Tel/boru tertibatını 15 dk.
   boyunca RT ve 500 rpm'de bir çalkalayıcıya aktarın not: Çalkalayıcının yörüngesi 1,5 mm'dir.
6. Tel/boru tertibatını bir santrifüje yerleştirin ve 10 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
7. Teli tüpten çıkarın, kapağı kapatın ve tüpü tekrar 300 x g'da 10 dk.
   santrifüjleyin not: Tel, ayırma verimliliğini değerlendirmek/tel üzerinde kalan hücreleri kontrol etmek için hücre sayımı için karanlıkta 2-6 °C'de 1x PBS'de saklanabilir.
8. Hücre süspansiyonunun hacmini azaltmak için, süpernatantın 100 μL (mikromanipülasyon) veya alternatif olarak 300 μL (sitosantrifüjleme ve müteakip lazer mikrodiseksiyon) hariç tümünü çıkarın ve hemen tek hücreli örneklemeye geçin.

Sonuçlar

Şekil 1: Etiketli hücreleri görselleştirme.(A,E) Şarj etmeden önce hücreler: Hücreler CFSE ile etiketlenir ve bir dizi CFSE (yeşil) sinyal yoğunluğu gösteren bir DNA ara tabaka boyası ile karşı boyanır. (B,F) Tel üzerinde yakalanan etiketli hücreler. (C,G) Hücre ayırma işleminden sonra tel. (D...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gilupi Serbest Bırakma Tamponu	Gilupi Dili	GIL083 Serisi	Hücreleri telden ayırmak için kullanılır
McCoy's 5A Orta (1x) takviye L-Glutamin ile	Thermo Fisher Bilimsel	16600-082	HT-29 hücreleri için kullanılan kültür ortamı, deneyler için kullanılan kültür ortamını hücre hattına uyarlar
HEPES Tampon Çözeltisi (1 M)	PAA (Türkçe)	S11-001 Serisi	McCoy's 5A Medium için ek
Fetal Sığır Serumu Altın	PAA (Türkçe)	A15-151	McCoy's 5a Modifiye Ortamı için Ek
Penisilin-Streptomisin (100x)	Biyobatı	L0018-100	McCoy's 5a Modifiye Ortamı için Ek
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x PBS)	Thermo Fisher Bilimsel	10010-015
Aktataz	Biyobatı	L0950-100	Hücre ayrılma çözeltisi (hücre kültürü)
Su banyosu	GFL (Cesaret Numarası	1003 yazın	Ön ısıtma çözeltileri için kullanılır
kuvöz	Thermo Fisher Bilimsel		Hücreleri inkübe etmek için kullanılır (hücre kültürü)
50 mL reaksiyon tüpleri	VWR (VWR)	525-0403
Silindirli karıştırıcı	Stuart Bilimsel	SRT6D	Hücrelerin çökelmesini önlerken hücreleri tele bağlamak için kullanılır
CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon Kiti	Thermo Fisher Bilimsel	C34554	Canlı hücreleri etiketlemek için kullanılır (sitoplazmik etiket)
Hoechst 33342	H3570	Thermo Fisher Bilimsel	DNA'yı boyamak için kullanılır (nükleik karşı leke)
Santrifüj (15 mL ve 50 mL reaksiyon tüplerini tutmak için donatılmıştır)	Thermo Fisher Bilimsel	Heraeus Megafüj 40R	Hücreleri peletlemek için kullanılır
Observer Z1 (Floresan/lazer mikrodiseksiyon mikroskobu)	Carl Zeiss Mikro Görüntüleme		Lazer mikrodiseksiyon yapabilen ters (immünofloresan) mikroskop; Floresan mikroskopları Hoechst 33342 (DAPI filtresi) ve CFSE'yi (FITC filtresi) algılayabilmelidir
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Cam/plastik yüzeyleri kaplamak için kullanılır
MS1 Mini Çalkalayıcı	Sigma-Aldrich	Z404039	Girdap için kullanılır
Vacutainer EDTA (veya Na-heparin) tüpleri	Bd	366450 (veya 366480)	Hedef hücrelerin ex vivo yakalanması için reaksiyon tüpü olarak kullanılır
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi Dili	GIL003 Serisi	EpCAM pozitif hücreleri izole edebilen ve ayırabilen işlevselleştirilmiş tel (yakala ve bırak, C&R olarak da adlandırılır)
Şırınga iğneleri (G20)	VWR (VWR)	613-0554	C&R'nin işlevsel olmayan kısmının içinden geçmesine izin vermek için lastik kapakları delmek için kullanılır
Neubauer odası	Roth	T729.1 Serisi	Hücreleri saymak için kullanılır
Pastör pipetleri 150 mm	Volac Belediyesi	D810	Hücrelerin C&R'ye düşük hacimli uygulanması için kullanılır
Yağlı kalem	Dako Belediyesi	S2002 Serisi	Hücre süspansiyonunu yerinde tutmak için cam kızaklarda kullanılır
Steril şırınga filtresi (0,2 μm)	Corning	431219	Taze hazırlanmış Gilupi Release Buffer'ı filtrelemek için
Delfia Plaka Çalkalayıcı	Perkin Elmer	1296-003	Hücre ayrılması sırasında ajitasyon için kullanılır
1,5 mL tüpler	Eppendorf Belediyesi	30.125.150
Ampli1 WGA Takımı	Silikon Biyosistemler		Silicon Biosystems üzerinden sipariş verilecek
Axiovert M200, Mikromanipülatör MMJ ve CellTram vario ile donatılmıştır	Zeiss/Eppendorf		Eldeki mikromanipülasyonu kullanın
Mikrokılcal damarlar (25 μm çapında), CustomTip I	Eppendorf Belediyesi	930001201	Hücreleri mikromanipüle etmek için kullanılır
0.2 mL PCR tüpleri	Biyozym	710920
Sitosantrifüj ve ekipmanları	Hettich	Evrensel 32	Elinizde sitosantrifüj kullanın
Termo döngüleyici	Biyo-Rad	DNA Motor Dyad	Isıtmalı kapaklı her termo döngüleyici kullanılabilir
Mikrosantrifüj	Roth	CX73.1	Elinizin altında masa üstü santrifüj kullanın
Membran Kaydırağı 1.0 PET	Zeiss	415101-4401-050	Lazer mikrodiseksiyon için kullanılan membran kaplı cam slaytlar