Mikromanipülasyon Kullanarak Tek Hücre Örneklemesi: Tek Hücreleri Kanser Hücresi Süspansiyonundan İzole Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Chen S. et al. Tek Hücreli Alt Akış Karakterizasyonu için Hedef Hücre Ön Zenginleştirme ve Tüm Genom Amplifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, aşağı akış analizi yapmak için hedef hücrelerden oluşan bir havuzdan tek hücreleri izole etme tekniği açıklanmaktadır. Bu yöntemde, tek bir hedef hücrenin yüksek hassasiyetli izolasyonu için mikroskoba takılan bir mikromanipülatör kullanılır.

Protokol

1. Tek Hücreli Örnekleme

1. Mikromanipülasyon
   NOT: Tüm genom analizi (WGA) gibi aşağı akış uygulamalarına izin vermek için, izole edilmiş tek hücreler 2 μL hücre lizis ana karışımına eklenecektir. İşlenecek hücre sayısına göre bir ana karışım hazırlayın. Pipetlemeden kaynaklanan ekstra hacimleri hesaplayın ve hücre lizis ana karışımını buzun üzerine yerleştirin.
   1. Hücre lizis ana karışımını hazırlayın (WGA kitinin bileşenleri, Malzeme ve Reaktifler Tablosu). Kısaca, 2.0 μL reaksiyon tamponu, 1.3 μL oktilfenoksipolietoksietanol (%10 çözelti), 1.3 μL 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol (%10 çözelti), 2.6 μL proteinaz K çözeltisi ve 12.8 μL RNaz/DNaz içermeyen su karıştırılarak 10 numune (toplam hacim 20 μL) için bir ana karışım elde edin.
      not: Daha fazla numune için hacimleri buna göre artırın.      
   2. Hücre süspansiyonunu yerinde tutan bir alan çizmek için bir gres kalemi kullanın. Hücre yoğunluğu çok yüksekse alanı ve hacmi ayarlayın (yani, cam slaytta daha büyük bir alanı işaretleyin, 1x PBS ve hücre süspansiyonunun bir kısmını yükleyin).
   3. Tüm hedef hücre süspansiyonunu cam slayta pipetleyin.
   4. Cam slaytı bir mikromanipülatör ile donatılmış bir mikroskoba aktarın. Hücrelerin 5 dakika oturmasına izin verin.
   5. 2.0 μL hücre lizis ana karışımı (adım 1.1.1'de hazırlanmıştır) ile yüklenmiş 0.2 mL PCR tüplerini hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
   6. Mikromanipülatörü kullanarak 1 μL 1x PBS'de tek hücreleri toplayın ve hücreleri hücre lizis ana karışımı içeren bir tüpe aktarın.
      not: Mikromanipüle edilmiş hücreleri hücre lizis tamponuna aktarmak için, kılcal damarı doğrudan 2 μL lizis çözeltisine yerleştirin ve kabarcıklar görünene kadar çıkarın.
   7. Tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak için bir masaüstü mikrofüj kullanarak numuneyi 3 saniye boyunca 2000 x g'da kısaca döndürün. Numuneleri buzun üzerine yerleştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x PBS)	Thermo Fisher Bilimsel	10010-015
Vacutainer EDTA (veya Na-heparin) tüpleri	Bd	366450 (veya 366480)	Hedef hücrelerin ex vivo yakalanması için reaksiyon tüpü olarak kullanılır
Pastör pipetleri 150 mm	Volac Belediyesi	D810	Hücrelerin C&R'ye düşük hacimli uygulanması için kullanılır
Yağlı kalem	Dako Belediyesi	S2002 Serisi	Hücre süspansiyonunu yerinde tutmak için cam kızaklarda kullanılır
Axiovert M200, Mikromanipülatör MMJ ve CellTram vario ile donatılmıştır	Zeiss/Eppendorf		Eldeki mikromanipülasyonu kullanın
Mikrokılcal damarlar (25 μm çapında), CustomTip I	Eppendorf Belediyesi	930001201	Hücreleri mikromanipüle etmek için kullanılır
0.2 mL PCR tüpleri	Biyozym	710920

Serisi