Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu Kullanılarak Tek Hücre Örneklemesi: Heterojen Bir Hücre Popülasyonundan Hedef Hücreleri Hasat Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Chen S. et al. Tek Hücreli Alt Akış Karakterizasyonu için Hedef Hücre Ön Zenginleştirme ve Tüm Genom Amplifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanılarak heterojen bir hücre popülasyonundan tek bir hücre elde etme tekniği açıklanmaktadır. İzole edilen tek hücre, daha ileri genomik çalışmalar veya kanser araştırmaları için kullanılabilir.

Protokol

1. Tek Hücreli Örnekleme

1. Lazer Mikrodiseksiyon
   NOT: WGA için 4.5 μL hücre lizis ana karışımına (WGA kitinin bileşenleri, Malzeme ve Reaktifler Tablosu) tek hücreler eklenecektir.
   1. 5.0 μL reaksiyon tamponu, 1.3 μL oktilfenoksipolietoksietanol (%10 çözelti), 1.3 μL 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilen glikol (%10 çözelti), örneğin 2.6 μL proteinaz K çözeltisi ve 34.8 μL RNaz/DNaz içermeyen su karıştırarak 10 numune (toplam hacim 45 μL) için bir ana karışım elde etmek üzere hücre lizis ana karışımını hazırlayın. Ana karışımı buz.
      üzerine yerleştirin not: Daha fazla numune için hacimleri buna göre artırın.
   2. Lazer mikrodiseksiyon için uygun membran kaplı slaytları UV ile tedavi edin. Slaytları bir DNA çapraz bağlayıcı cihazına yerleştirin ve yaklaşık 10 dakika boyunca en yüksek UV'ye maruz bırakın.
   3. Membran kaplı slaydı bir sitosantrifüjde birleştirin ve tüm hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da sitospin
      not: Hücrelerin çözelti içindeki slayt üzerine sitosantrifüj edildiği bir sıvı içi sistem kullanırken, sitosantrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın ve 1 dakika boyunca 1140 x g'da kuru bir dönüş uygulayın.
   4. Doğrudan lazer mikrodiseksiyona devam edin veya sitospinlerin gece boyunca kurumasına izin verin ve uzun süreli saklama için numuneleri -20 °C'de dondurun.
   5. 4,5 μL hücre lizis ana karışımını 0,2 mL'lik bir PCR tüpünün kapağına pipetleyin ve lazer mikrodiseksiyon yoluyla tek hücreleri hasat edin.
   6. PCR tüpünü lazer mikrodiseksiyon mikroskobundan alın ve tüpü kapatın. Kısa sıkma ile tüpün altındaki tüm sıvıyı toplayın ve numuneyi buzun üzerine yerleştirin.
   7. Tek hücreli WGA ile devam edin veya izole edilen numuneleri daha fazla işlemden önce 1 aya kadar -80 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
McCoy's 5A Orta (1x) takviye L-Glutamin ile	Thermo Fisher Bilimsel	16600-082	HT-29 hücreleri için kullanılan kültür ortamı, deneyler için kullanılan kültür ortamını hücre hattına uyarlar
HEPES Tampon Çözeltisi (1 M)	PAA (Türkçe)	S11-001 Serisi	McCoy's 5A Medium için ek
Fetal Sığır Serumu Altın	PAA (Türkçe)	A15-151	McCoy's 5a Modifiye Ortamı için Ek
Penisilin-Streptomisin (100x)	Biyobatı	L0018-100	McCoy's 5a Modifiye Ortamı için Ek
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x PBS)	Thermo Fisher Bilimsel	10010-015
Aktataz	Biyobatı	L0950-100	Hücre ayrılma çözeltisi (hücre kültürü)
Su banyosu	GFL (Cesaret Numarası	1003 yazın	Ön ısıtma çözeltileri için kullanılır
kuvöz	Thermo Fisher Bilimsel		Hücreleri inkübe etmek için kullanılır (hücre kültürü)
50 mL reaksiyon tüpleri	VWR (VWR)	525-0403
Silindirli karıştırıcı	Stuart Bilimsel	SRT6D	Hücrelerin çökelmesini önlerken hücreleri tele bağlamak için kullanılır
CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon Kiti	Thermo Fisher Bilimsel	C34554	Canlı hücreleri etiketlemek için kullanılır (sitoplazmik etiket)
Hoechst 33342	H3570	Thermo Fisher Bilimsel	DNA'yı boyamak için kullanılır (nükleik karşı leke)
Santrifüj (15 mL ve 50 mL reaksiyon tüplerini tutmak için donatılmıştır)	Thermo Fisher Bilimsel	Heraeus Megafüj 40R	Hücreleri peletlemek için kullanılır
Observer Z1 (Floresan/lazer mikrodiseksiyon mikroskobu)	Carl Zeiss Mikro Görüntüleme		Lazer mikrodiseksiyon yapabilen ters (immünofloresan) mikroskop; Floresan mikroskopları Hoechst 33342 (DAPI filtresi) ve CFSE'yi (FITC filtresi) algılayabilmelidir
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Cam/plastik yüzeyleri kaplamak için kullanılır
MS1 Mini Çalkalayıcı	Sigma-Aldrich	Z404039	Girdap için kullanılır
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi Dili	GIL003 Serisi	EpCAMpositive hücrelerini izole edebilen ve ayırabilen işlevselleştirilmiş tel (yakala ve bırak, C&R olarak da adlandırılır)
Şırınga iğneleri (G20)	VWR (VWR)	613-0554	C&R'nin işlevsel olmayan kısmının içinden geçmesine izin vermek için lastik kapakları delmek için kullanılır
Neubauer odası	Roth	T729.1 Serisi	Hücreleri saymak için kullanılır
Pastör pipetleri 150 mm	Volac Belediyesi	D810	Hücrelerin C&R'ye düşük hacimli uygulanması için kullanılır
Yağlı kalem	Dako Belediyesi	S2002 Serisi	Hücre süspansiyonunu yerinde tutmak için cam kızaklarda kullanılır
Delfia Plaka Çalkalayıcı	Perkin Elmer	1296-003	Hücre ayrılması sırasında ajitasyon için kullanılır
1,5 mL tüpler	Eppendorf Belediyesi	30.125.150
Ampli1 WGA Takımı	Silikon Biyosistemler		Silicon Biosystems üzerinden sipariş verilecek
0.2 mL PCR tüpleri	Biyozym	710920
Sitosantrifüj ve ekipmanları	Hettich	Evrensel 32	Elinizde sitosantrifüj kullanın
Termo döngüleyici	Biyo-Rad	DNA Motor Dyad	Isıtmalı kapaklı her termo döngüleyici kullanılabilir
Mikrosantrifüj	Roth	CX73.1	Elinizin altında masa üstü santrifüj kullanın
UV Tabaka Bağlayıcı 1800	Strateji	400072	Eldeki DNA çapraz bağlayıcıyı kullanın

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi