Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu Kullanılarak Tek Hücre Örneklemesi: Heterojen Bir Hücre Popülasyonundan Hedef Hücreleri Hasat Etme Tekniği

1. Tek Hücreli Örnekleme

1. Lazer Mikrodiseksiyon
   NOT: WGA için 4.5 μL hücre lizis ana karışımına (WGA kitinin bileşenleri, Malzeme ve Reaktifler Tablosu) tek hücreler eklenecektir.
   1. 5.0 μL reaksiyon tamponu, 1.3 μL oktilfenoksipolietoksietanol (%10 çözelti), 1.3 μL 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilen glikol (%10 çözelti), örneğin 2.6 μL proteinaz K çözeltisi ve 34.8 μL RNaz/DNaz içermeyen su karıştırarak 10 numune (toplam hacim 45 μL) için bir ana karışım elde etmek üzere hücre lizis ana karışımını hazırlayın. Ana karışımı buz.
      üzerine yerleştirin not: Daha fazla numune için hacimleri buna göre artırın.
   2. Lazer mikrodiseksiyon için uygun membran kaplı slaytları UV ile tedavi edin. Slaytları bir DNA çapraz bağlayıcı cihazına yerleştirin ve yaklaşık 10 dakika boyunca en yüksek UV'ye maruz bırakın.
   3. Membran kaplı slaydı bir sitosantrifüjde birleştirin ve tüm hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da sitospin
      not: Hücrelerin çözelti içindeki slayt üzerine sitosantrifüj edildiği bir sıvı içi sistem kullanırken, sitosantrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın ve 1 dakika boyunca 1140 x g'da kuru bir dönüş uygulayın.
   4. Doğrudan lazer mikrodiseksiyona devam edin veya sitospinlerin gece boyunca kurumasına izin verin ve uzun süreli saklama için numuneleri -20 °C'de dondurun.
   5. 4,5 μL hücre lizis ana karışımını 0,2 mL'lik bir PCR tüpünün kapağına pipetleyin ve lazer mikrodiseksiyon yoluyla tek hücreleri hasat edin.
   6. PCR tüpünü lazer mikrodiseksiyon mikroskobundan alın ve tüpü kapatın. Kısa sıkma ile tüpün altındaki tüm sıvıyı toplayın ve numuneyi buzun üzerine yerleştirin.
   7. Tek hücreli WGA ile devam edin veya izole edilen numuneleri daha fazla işlemden önce 1 aya kadar -80 °C'de saklayın.