Method Article

Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu Kullanılarak Tek Hücre Örneklemesi: Heterojen Bir Hücre Popülasyonundan Hedef Hücreleri Hasat Etme Tekniği

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Chen S. et al. Tek Hücreli Alt Akış Karakterizasyonu için Hedef Hücre Ön Zenginleştirme ve Tüm Genom Amplifikasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanılarak heterojen bir hücre popülasyonundan tek bir hücre elde etme tekniği açıklanmaktadır. İzole edilen tek hücre, daha ileri genomik çalışmalar veya kanser araştırmaları için kullanılabilir.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tek Hücreli Örnekleme

  1. Lazer Mikrodiseksiyon
    NOT: WGA için 4.5 μL hücre lizis ana karışımına (WGA kitinin bileşenleri, Malzeme ve Reaktifler Tablosu) tek hücreler eklenecektir.
    1. 5.0 μL reaksiyon tamponu, 1.3 μL oktilfenoksipolietoksietanol (%10 çözelti), 1.3 μL 4- (1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilen glikol (%10 çözelti), örneğin 2.6 μL proteinaz K çözeltisi ve 34.8 μL RNaz/DNaz içermeyen su karıştırarak 10 numune (toplam hacim 45 μL) için bir ana karışım elde etmek üzere hücre lizis ana karışımını hazırlayın. Ana karışımı buz.
      üzerine yerleştirin ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
McCoy's 5A Orta (1x) takviye L-Glutamin ileThermo Fisher Bilimsel16600-082HT-29 hücreleri için kullanılan kültür ortamı, deneyler için kullanılan kültür ortamını hücre hattına uyarlar
HEPES Tampon Çözeltisi (1 M)PAA (Türkçe)S11-001 SerisiMcCoy's 5A Medium için ek
Fetal Sığır Serumu AltınPAA (Türkçe)A15-151McCoy's 5a Modifiye Ortamı için Ek
Penisilin-Streptomisin (100x)BiyobatıL0018-100McCoy's 5a Modifiye Ortamı için Ek
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x PBS)Thermo Fisher Bilimsel10010-015
AktatazBiyobatıL0950-100Hücre ayrılma çözeltisi (hücre kültürü)
Su banyosuGFL (Cesaret Numarası1003 yazınÖn ısıtma çözeltileri için kullanılır
kuvözThermo Fisher BilimselHücreleri inkübe etmek için kullanılır (hücre kültürü)
50 mL reaksiyon tüpleriVWR (VWR)525-0403
Silindirli karıştırıcıStuart BilimselSRT6DHücrelerin çökelmesini önlerken hücreleri tele bağlamak için kullanılır
CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon KitiThermo Fisher BilimselC34554Canlı hücreleri etiketlemek için kullanılır (sitoplazmik etiket)
Hoechst 33342H3570Thermo Fisher BilimselDNA'yı boyamak için kullanılır (nükleik karşı leke)
Santrifüj (15 mL ve 50 mL reaksiyon tüplerini tutmak için donatılmıştır)Thermo Fisher BilimselHeraeus Megafüj 40RHücreleri peletlemek için kullanılır
Observer Z1 (Floresan/lazer mikrodiseksiyon mikroskobu)Carl Zeiss Mikro GörüntülemeLazer mikrodiseksiyon yapabilen ters (immünofloresan) mikroskop; Floresan mikroskopları Hoechst 33342 (DAPI filtresi) ve CFSE'yi (FITC filtresi) algılayabilmelidir
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA4503-50GCam/plastik yüzeyleri kaplamak için kullanılır
MS1 Mini ÇalkalayıcıSigma-AldrichZ404039Girdap için kullanılır
Detektor CANCER03 DC03Gilupi DiliGIL003 SerisiEpCAMpositive hücrelerini izole edebilen ve ayırabilen işlevselleştirilmiş tel (yakala ve bırak, C&R olarak da adlandırılır)
Şırınga iğneleri (G20)VWR (VWR)613-0554C&R'nin işlevsel olmayan kısmının içinden geçmesine izin vermek için lastik kapakları delmek için kullanılır
Neubauer odasıRothT729.1 SerisiHücreleri saymak için kullanılır
Pastör pipetleri 150 mmVolac BelediyesiD810Hücrelerin C&R'ye düşük hacimli uygulanması için kullanılır
Yağlı kalemDako BelediyesiS2002 SerisiHücre süspansiyonunu yerinde tutmak için cam kızaklarda kullanılır
Delfia Plaka ÇalkalayıcıPerkin Elmer1296-003Hücre ayrılması sırasında ajitasyon için kullanılır
1,5 mL tüplerEppendorf Belediyesi30.125.150
Ampli1 WGA TakımıSilikon BiyosistemlerSilicon Biosystems üzerinden sipariş verilecek
0.2 mL PCR tüpleriBiyozym710920
Sitosantrifüj ve ekipmanlarıHettichEvrensel 32Elinizde sitosantrifüj kullanın
Termo döngüleyiciBiyo-RadDNA Motor DyadIsıtmalı kapaklı her termo döngüleyici kullanılabilir
MikrosantrifüjRothCX73.1Elinizin altında masa üstü santrifüj kullanın
UV Tabaka Bağlayıcı 1800Strateji400072Eldeki DNA çapraz bağlayıcıyı kullanın
Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionSingle Cell IsolationCytocentrifuge TechniqueCell Suspension PreparationMembrane Coated SlideUV Light TreatmentCell Lysis Master MixPCR Tube CollectionHeterogeneous Cell PopulationTarget Cell Harvesting

Related Articles