Kemodirençli Prostat Kanseri Hücrelerinin Oluşturulması: İn Vitro İlaca Dirençli Kanser Hücrelerinin Elde Edilmesi İçin Bir Prosedür

Özet

Kaynak: Mohr, L. et al. Anti-mitotik Ajan Dosetaksele Direnç Prostat Kanseri Hücre Modellerinin Oluşturulması. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, prostat kanserinin taksana dirençli hücre modellerinin oluşturulması için bir protokol açıklanmaktadır. Bu modeller, prostat kanseri hastalarında dosetaksel direncine ilerlemede rol oynayan yolların incelenmesine yardımcı olabilir.

Protokol

1. Dosetaksele dirençli prostat kanseri hücrelerinin üretilmesi

NOT: IC50 ilaç konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanılan Docetaxel solüsyon stoğunu kullanarak hücre tedavileri gerçekleştirin (deneysel kullanım için önceden yeterli stok hazırlayın). Ebeveyn hücreleri, tüm prosedür boyunca küçük bir şişede paralel olarak büyütülmeli ve Dosetaksel ile muamele edilmiş şişelerde kullanılan miktarları taklit eden karşılık gelen hacimlerde araca (DMSO) maruz bırakılmalıdır.

1. 20 mL ortam içeren 150 cm'lik² şişede DU145 veya 22Rv1 hücrelerini plakalayın (DU145 için şişe başına 3,5 x^{10 6} hücre ve 22Rv1 için şişe başına 6,5 x^{10 6} hücre). Protokolün sonunda yeterli hücreye sahip olmak için 10 ila 20 şişe hücre kullanılması önerilir.
2. 24 saat sonra, hücreler yaklaşık% 70-80 birleşimde olduğunda (Şekil 1B, Docetaxel'den önce), IC50 konsantrasyonunda Docetaxel ekleyin (bu protokolde açıklanan hücreler için 5 nM).
3. 72 saat sonra, ilaç içeren besiyerini aspire edin ve taze, Dosetaksel içermeyen besiyeri ekleyin (Şekil 1B, Dosetaksel'den 72 saat sonra). Medyayı her 3-4 günde bir değiştirin. Yaklaşık 1-2 hafta içinde, dirençli klonlar mikroskop altında belirgin görünecektir (Dosetakselden 1B, 7 ve 14 gün sonra).
4. Aspire ortamı, hücreleri 15 mL PBS ile dikkatlice yıkayın ve hücreleri şişe yüzeyinden ayırmak için 4 mL% 0.05 Tripsin-EDTA ile 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
5. 8 mL taze ortam kullanarak tripsinli hücreleri şişeden yeniden süspanse edin. İşlem görmüş tüm şişelerden havuz hücreleri. Santrifüjleme ile pelet hücreleri (300 x g, 3 dk, RT).
6. Süpernatanı çıkarın, hücre peletini 20 mL taze ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri 150 cm'lik² şişelere yerleştirin (DU145 için şişe başına 3.5 x^{10 6} hücre ve 22Rv1 için şişe başına 6.5 x^{10 6} hücre).
7. 24 saat sonra, hücreler yaklaşık% 70-80 birleşimde olduğunda, tekrar 5 nM Docetaxel (ilk IC50 konsantrasyonu) ekleyin.
8. 3. günde 1.3 ila 1.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
9. 24 saat sonra, hücreler yaklaşık% 70-80 birleşimde olduğunda, bunları 2X IC50 Docetaxel konsantrasyonu (bu protokolde açıklanan hücreler için 10 nM) ile tedavi edin.
10. Dosetaksel konsantrasyonlarının (25 nM, 50 nM, 100 nM ve 250 nM) doz artışını takiben, son en yüksek konsantrasyon altında şişelerde büyüyen stabil bir hücre popülasyonu oluşturmak için 1.3 ila 1.8 arasındaki adımları tekrarlayın. Daha yüksek konsantrasyonlar için, doz yükseltme protokolü, 1.000 nM konsantrasyona ulaşılana kadar 6 aya kadar uygulanabilir (Şekil 2A).

Sonuçlar

Şekil 1: Dosetaksele dirençli prostat kanseri hücre model sistemlerinin oluşturulması.(A) Ebeveyn prostat kanseri hücre hatları DU145 ve 22Rv1'de Docetaxel IC50'nin belirlenmesini gösteren diyagram (protokolün 1. adımı). Beklenen hücre canlılığı yüzdeleri ve ihtiyaç duyulan Docetaxel doz arttırıcı konsantrasyonlar dahil edilmiştir. 72 saatlik Dosetaksel maruziyetinden sonra IC50 olara...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DU145 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-81
22Rv1 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2505
Dosetaksel	Selleck Kimyasalları	S1148 Serisi	DMSO'da (10mM)
Doku kültürü şişesi 150cm^{2}	doğan	355001
RPMI 1640 Orta	Gibco (Gibco)	11875093	%10 FBS ve ile desteklenmiştir % 1 Penisilin / Streptomisin
Fondöten B Fetal Sığır Serumu	Gemini	900208
1X Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuzlu (PBS)	Corning	21-040-CM
% 0.05 Tripsin-EDTA	Gibco (Gibco)	25300-062
Penisilin-Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140122

Serisi Serisi