Prostat Kanseri Hücrelerinde ADI Tabanlı Otofaji İndüksiyonu: Hücrelerde Otofajik Yanıtı Ölçmek İçin Enzim Tabanlı Bir Teknik

1. Hücreleri Canlı Görüntüleme için Hazırlama

1. 35 mm poli-D-lizin kaplı cam tabanlı kültür kaplarında %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren RPMI kültür ortamında yeşil floresan proteine bağlı Hafif Zincir 3 (LC3-GFP) eksprese eden CWR22Rv1 hücrelerini büyütün. Hücreler, hızlı çoğalmayı kolaylaştırmak için yeterli yoğunlukta kaplanmalıdır, ancak hücrelerin görüntüleme sırasında aşırı büyüyüp kümeleneceği kadar fazla olmamalıdır.
2. Seçilen hücre örneklerini PBS'de ADI (0.3 μg / mL) ile tedavi edin.
3. Görüntülemeden yaklaşık 1 saat önce, 1.5 μl LysoTracker Red DND-99'u (Invitrogen, CA) %10 FBS ve %1 antibiyotik içeren 20 mL RPMI ile seyreltin. Seçilen numuneler için ADI içeren solüsyonlar kullanın. Kültür kabına eklemeden önce tüm ortamları 37 °C'ye ısıtın.
4. Hücreleri LysoTracker Red DND-99 içeren RPMI ile 37 ° C'de 15-45 dakika inkübe edin.
5. Görüntülemeden yaklaşık 30 dakika önce, WeatherStation çevre muhafazasını açın ve 37 °C ve% 5 CO_2'ye (nemlendirilmiş hava ile) dengelenmesini bekleyin.
6. Hücreleri PBS ile yıkayın ve ortamı sadece% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren standart RPMI ile değiştirin. Belirtildiği gibi örneklere ADI ekleyin.
7. 35 mm kapaklı cam tabanlı kültür kaplarını özelleştirilmiş adaptöre (Applied Precision, Inc., WA) monte edin ve mikroskop tablasına yerleştirin. 60X 1.42 NA objektif lensinde daldırma yağı (kırılma indisi 1.520) kullanın ve monte edilen kültür kabını sahneye yerleştirin.

2. Süper çözünürlüklü, Yapısal Aydınlatma (OMX) Mikroskobu

>NOT: Bu bölümdeki protokol, OMX Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobunun (Uygulamalı Hassasiyet, WA) kullanımı için geçerlidir.

1. Ana gücü ve istenen lazerleri (410 nm, 488 nm ve/veya 532 nm) açın. Lazerlerin termal olarak stabilize olması için 20 dakika bekleyin.
2. 60X 1.516 NA objektif lensine daldırma yağı (RT'de sabit numuneler için kırılma indisi 1.42) ekleyin. Yağ damlacığında kabarcıklar görülürse, hedefi temizleyin ve tekrar yağ ekleyin.
3. Örnek slaytı sahneye yerleştirin ve gerekirse hücrelerin lamel üzerine yerleşmesi için 10 dakika bekleyin.
4. Alım programını başlatın. Hücrenin keskin bir taslağı görünene kadar odağı ayarlamak için floresan aydınlatmayı kullanın.
   not: Gerçek görüntü elde edilene kadar hücrelerin floresan uyarımına maruz kalmasını en aza indirmek için her zaman özen gösterilmelidir.
5. İlgilenilen hücreleri veya bölgeleri seçmek için numunenin daha geniş alanlarını önizlemek için bir spiral mozaik taraması elde edilebilir. Numuneyi tararken veya hedefleri bulurken kısa maruz kalma süreleri (1-10 msn) ve düşük uyarma gücü (%0,1-1 iletim) kullanılması önerilir.
6. Otofagozomları GFP-LC3 floresan ile tanımlayın. Alexa Fluor 555 anti-LAMP (lizozomla ilişkili zar proteini) ile lizozomları ve DAPI (sabit numuneler) kullanarak hücre çekirdeklerini tanımlayın.
7. Uyarma dalga boyu, görüntü alanı (örn. 512x512), yığın kalınlığı, pozlama süresi ve lazer iletim yüzdesi gibi deneysel koşulları seçin. Süper çözümlenmiş görüntüler için, yapılandırılmış aydınlatma seçeneğinin etkinleştirildiğinden emin olun. OMX'te evrişim mikroskobu için geleneksel aydınlatma seçeneğini seçin.
8. En iyi rekonstrüksiyon sonuçları için, satın alma sırasında maksimum yoğunluk sayısı 10.000 ile 15.000 arasında olacak şekilde deneysel koşulları seçin. Foto ağartma söz konusuysa, daha düşük bir pozlamada (5.000 ila 10.000 arasında sayılar) görüntüleme kullanılabilir. İdeal olarak, sayımlar tüm satın alma boyunca iki faktörden fazla azalmamalı ve dört faktörden fazla azalmalardan kaçınılmalıdır. Gerekirse, sürekli bir yoğunluk sayımı sağlamak için yığın kalınlığını azaltın. Kamera 64.000 sayımda doygunluğa ulaşır, bu nedenle maksimum yoğunluk bunu asla aşmamalıdır. İyi numuneler için, deney koşullarının %1 lazer iletimi ile 10 ~ 50 msn maruz kalma süresi olduğunu bulduk. Tekrar tekrar görüntülenebilen parlak ve fotostabil örnekler tercih edilir. Zaman atlamalı, süper çözünürlüklü görüntüler için sabit bir leke gereklidir.
9. Gürültüyü azaltmak için 95 MHz okuma hızı (Orta hız seçeneği) ve 2 msn veya daha fazla çekim süresi önerilir. Numune edinme sırasında hareket ettiğinde yeniden oluşturulan görüntüde artan artefaktlar elde edilir. Bu etki nedeniyle, yapışık olmayan veya hızlı hareket eden hücreler için kısa pozlamalar önerilir.
10. Çok kanallı görüntüleme aynı anda veya ardışık olarak gerçekleştirilebilir. Sıralı mod daha az karışma sağlar ve bu nedenle önerilir.
11. Foto ağartmayı azaltmak için, genellikle önce daha uzun uyarma dalga boylarıyla (532 nm, 488 nm ve sonra 410 nm) görüntüleme yapılması önerilir. Bununla birlikte, Şekil 1'de gösterilen deneysel sonuçlar için, bu özel numunenin fotostabilitesi nedeniyle bu sıra tersine çevrildi (yani, 48 nm, 532 nm ve 410 nm).
12. Mikroskop aşamasını hücrelerin üstü/altı biraz odak dışına çıkana kadar hareket ettirerek Z yığınının üst/alt sınırını ayarlayın. Yeniden yapılandırma yazılımı bu değeri varsayılan olarak aldığından, süper çözünürlüklü görüntüleme için her görüntü arasındaki istenen mesafe 0,125 μm'de sabit tutulmalıdır.
13. SoftWorX (Applied Precision, WA) kullanarak görüntü yığınlarını yeniden oluşturun ve VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA) kullanarak analiz edin.

Şekil 1. Hücrede otofagozom ve lizozom dağılımı.A. Üst) OMX mikroskobu (sağda) kullanılarak DV modunda (simüle edilmiş geniş alan evrişim dekonvolüyonu, solda) ve yapılandırılmış aydınlatma modunda elde edilen ve yeniden oluşturulan görüntülerin yan yana karşılaştırılması. Ölçek çubuğu 5 μm'yi temsil eder. B. Alt) Otofagozomların ve lizozomların küçük ölçekli kolokalizasyonu (oklarla gösterilir).