Protein Ekstraksiyonu ve Proteoliz: Prostat Tümör Dokusu Örneklerinden Protein Elde Etme ve Bunların Peptitlere Enzimatik Sindirimi İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Cheng, L. C. et al. Prostat Kanserinde Fosfoproteomu Araştırmak için Etiketsiz Kantitatif Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş Fosfopeptit Zenginleştirme. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, prostat tümör dokusundan peptitler elde etmek için protein ekstraksiyonu ve sindirim tekniği açıklanmaktadır. Daha ileri analizlerdeki bu peptitler, onkoterapi için yeni hedeflerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Protokol

1. Protein Ekstraksiyonu

1. Lizis tamponunu hazırlayın (Tablo 1). (Hacim, hasat edilecek numune sayısına bağlıdır.)
2. Doku toplama
   1. Tümörü tartın ve bir kültür test tüpündeki her 100 mg doku için 2 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. (Tipik olarak, 50 ila 150 mg doku ıslak ağırlığı gereklidir.)
3. Elde tutulan veya tezgah üstü bir homojenizatör kullanarak lizatı homojenize edin (2 saniye boyunca 15 kez darbe). Homojenizatörü ilk numuneden önce ve numuneler arasında art arda %10 çamaşır suyu, %70 etanol ve deiyonize su kullanarak temizleyin.
4. Azaltmak ve alkillemek için homojenize numuneleri 95 °C'de 5 dakika ısıtın. Daha sonra 15 dakika buz üzerinde soğutun. Buz üzerinde, lizatı 3x sonikasyon yapın (yani, darbeler arasında 60 saniye duraklama ile 30 saniye boyunca darbe). Numune bu noktada viskoz veya topaklanmış olmamalıdır. Lizatı 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
5. 15 dakika boyunca 15 ° C'de 3.500 x g'da bir salıncak kova rotoru kullanarak aynı sonikasyon tüpündeki lizatı santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve peleti atın.
6. Bir Bradford testi yaparak protein konsantrasyonunu belirleyin. Gerekirse, lizatı bir lizis tamponu ile 5 mg / mL'ye seyreltin. -20 °C.
   'de saklayın NOT: Deney burada duraklatılabilir. Numuneleri -80 °C'de dondurun ve daha fazla analiz için kullanın.

2. Lizat Sindirimi

1. Guanidinyum miktarını azaltmak için 100 mM Tris (pH = 8.5) kullanarak numuneyi 12 kat seyreltin. Eşit olmayan sindirimin etkilerini en aza indirmek için tüm numuneleri aynı hacme seyreltin. Coomassie lekeli bir jel üzerinde doğrulamak için 12,5 μg sindirilmemiş lizat kaydedin.
2. 5 mg protein için 10 μg Lysyl Endopeptidaz (Lys-C) ekleyin ve oda sıcaklığında 5-6 saat inkübe edin. 1 M titre edilmemiş Tris (pH ~ 11) ekleyerek pH'ı 8.0'a ayarlayın.
3. 1 mM HCl'de (20 mM CaCl₂ ile) 1 mg / mL L-1-tosylamido-2-feniletil klorometil keton (TPCK) ile muamele edilmiş tripsin hazırlayın. Tripsini 1:100 tripsin: protein oranında ekleyin ve 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
4. Adım 2.3'teki ile aynı miktarda taze tripsin ekleyin. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
5. Coomassie lekeli bir jel üzerinde tam sindirimi doğrulamak için 12,5 μg sindirilmiş lizat kaydedin.

3. Ters Faz Ekstraksiyonu

1. Lizat hacmini kaydedin. 15 mL 10 kDa'lık bir kesme filtresi kullanarak numuneyi filtreleyin. Salıncak kova rotorunu (veya sabit açılı rotorda 3.500 x g) kullanarak numuneyi 15 °C'de 3.500 μg'da, tutma hacmi 250 μL'den az olana kadar (bu yaklaşık 45-60 dakika sürer) santrifüjleyin. Akışı toplayın ve kalıntıyı atın.

Tablo 1: Tamponlar ve çözeltiler.Bu tablo, bu protokolde kullanılan tamponların ve çözeltilerin bileşimlerini göstermektedir.

arabellek	hacim	kompozisyon
6 M guanidinyum klorür lizis tamponu	50 mL	6 M guanidinyum klorür, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin, 40 mM kloroasetamid, 2 mM sodyum ortovanadat, 2.5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM β-gliserofosfat, 500 mg n-oktil-glikozit, ultra saf su hacmine
100 mM sodyum pirofosfat	50 mL	2.23 g sodyum pirofosfat dekahidrat, hacimce ultra saf su
1M β-gliserofosfat	50 mL	15.31 g β-gliserofosfat, hacimce ultra saf su
% 5 trifloroasetik asit	20 mL	19 mL ultra saf suya 1 mL %100 trifloroasetik asit ekleyin
% 0.1 trifloroasetik asit	250 mL	245 mL ultra saf suya 5 mL %5 trifloroasetik asit ekleyin
pY elüsyon tamponu	250 mL	% 0.1 trifloroasetik asit,% 40 asetonitril, hacimce ultra saf su
pST elüsyon tamponu	250 mL	% 0.1 trifloroasetik asit,% 50 asetonitril, hacimce ultra saf su
IP bağlama arabelleği	200 mL	50 mM tris pH 7.4, 50 mM sodyum klorür, hacimce ultra saf su
25 mM amonyum bikarbonat, pH 7.5	10 mL	19.7 mg'ı 10 mL steril ultra saf suya, 1 N hidroklorik asit (~ 10-15 μL / 10 ml çözelti) ile pH 7.5'e çözün, taze yapın
1M fosfat tamponu, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M sodyum dihidrojen fosfat, 577 mL 1 M sodyum hidrojen fosfat
Dengeleme tamponu	14 mL	6,3 mL asetonitril, 280 μL %5 trifloroasetik asit, 1740 μL laktik asit, 5,68 mL ultra saf su
Durulama tamponu	20 mL	9 mL asetonitril, 400 μL %5 trifloroasetik asit, 10,6 mL ultra saf su
Kütle spektrometresi çözümü	10 mL	500 μL asetonitril, 200 μL %5 trifloroasetik asit, 9,3 mL ultra saf su
Tampon A	250 mL	5 mM monopotasyum fosfat (pH 2.65), %30 asetonitril, 5 mM potasyum klorür, hacimce ultra saf su
Tampon B	250 mL	5 mM monopotasyum fosfat (pH 2.65), %30 asetonitril, 350 mM potasyum klorür, hacimce ultra saf su
% 0.9 amonyum hidroksit	10 mL	300 μL %29,42 amonyum hidroksit, 9,7 mL ultra saf su

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ultra Düşük Sıcaklıklı Dondurucu	Panasonic Belediyesi	MDF-U76V
Dondurucu -20 °C	VWR (VWR)	SCPMF-2020 Tezli Muhafızlar
Salıncak rotorlu kova	ThermoFisher Bilimsel	75004377
Uçtan uca döndürücü	ThermoFisher Bilimsel	415110Q
Düşük protein bağlayıcı Eppendorf tüpleri	Eppendorf Belediyesi	22431081
Tripsin, TPCK Tedavi Edildi	Worthington Biyokimyasalları	LS003740
Lizil Endopeptidaz	Wako Saf Kimya Endüstrileri, Ltd.	125-05061
MilliQ su			Tüm çözeltileri ve tamponları hazırlamak için kullanılan deiyonize su
Sonik Çözücü	Balıkçı Bilimsel	FB-120	ses ikonikatörü
Polytron Sistemi PT	Kinematica AG	PT 10-35 GT	homojenizatör

Serisi