Peptit Saflaştırma: Sindirilmiş Protein Lizatlarından Peptitleri Çıkarmak için RP-HPLC Tabanlı Bir Teknik

Özet

Kaynak: Cheng, L. C. et al. Prostat Kanserinde Fosfoproteomu Araştırmak için Etiketsiz Kantitatif Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş Fosfopeptit Zenginleştirme. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, sindirilmiş bir protein lizat karışımından peptitleri saflaştırmak için ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisini gösteriyoruz. Bu saflaştırılmış peptitler daha sonra liyofilize edilir ve sonraki uygulamalar için depolanır. Peptitlerin analizi, hücresel sinyalleşme ve kanserde yer alan mekaniğin anlaşılmasına yardımcı olabilir.

Protokol

1. Ters Faz Ekstraksiyonu

1. Bir cam şişede önceden sindirilmiş bir protein lizatı ile başlayın. 15 mL 10 kDa'lık bir kesme filtresi kullanarak numuneyi filtreleyin. Numuneyi, tutma hacmi 250 μL'den az olana kadar (bu yaklaşık 45 - 60 dakika sürer) 15 °C'de döner kova rotorunu (veya sabit açılı bir rotorda 3.500 x g) kullanarak 3.500 x g'da santrifüjleyin. Akışı toplayın ve retentate.
   atın NOTE: Deney burada duraklatılabilir. Numuneleri daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de dondurun.
2. Numuneyi asitleştirmek için, mL lizat başına yaklaşık 20 μL %5 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin. Bunları iyice karıştırın ve pH şeritleri kullanarak numune pH'ını ölçün. %5 TFA kullanarak pH'ı 2,5'e ayarlayın.
3. Bir C-18 kolonunun kısa ucunu bir vakum manifolduna bağlayın. Vakumu 17 ila 34 kPa arasında ayarlayın (veya üreticinin talimatlarına göre). Cam pipetler kullanarak kolonu 3 mL %100 asetonitril (ACN) ile ıslatın. Kolonun kurumasına izin vermeyin.
4. Cam pipetler kullanarak, kolonu 2x 3 mL olarak uygulanan 6 mL %0,1 TFA ile dengeleyin. Asitlenmiş numuneyi kolona yükleyin. Bir seferde 3 mL'den fazla eklemeyin. Vakumu saniyede yaklaşık 1 ila 2 damla hedefleyecek şekilde ayarlayın.
5. Cam pipetler kullanarak, kolonu 3x 3 mL olarak uygulanan 9 mL %0,1 TFA ile yıkayın. Kolonu 2 mL %40 ACN, %0.1 TFA ile güçlendirin. İki adet 2 mL'lik fraksiyonu cam kültür tüplerine toplayın. Sütunu atın.
6. Eluat tüplerini parafilm ile örtün ve 20G'lik bir iğne kullanarak kapağa 3-5 delik açın. Eluatı tamamen katılaşana kadar kuru buz üzerinde en az 30 dakika dondurun.
7. Fraksiyonları gece boyunca liyofilize edin. Ertesi gün, liyofilizatörü durdurmadan önce numunelerin tamamen kuru olduğundan emin olun. Tüpleri 50 mL'lik konik bir tüpte -80 °C'de hassas mendillerle saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ultra Düşük Sıcaklıklı Dondurucu	Panasonic Belediyesi	MDF-U76V
Dondurucu -20 °C	VWR (VWR)	SCPMF-2020 Tezli Muhafızlar
Salıncak rotorlu kova	ThermoFisher Bilimsel	75004377
Vakum manifoldu	Restek	26080
Liyofilizatör	Laboratuvar Laboratuvarı	7420020
CentriVap Masaüstü Vakum Konsantratörü	Laboratuvar Laboratuvarı	7810010
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri	Kırlangıç Sigma	UFC901024
Uçtan uca döndürücü	ThermoFisher Bilimsel	415110Q
Cam kültür tüpleri	Balıkçı Bilimsel	14-961-26
Parafilm Filmi	Balıkçı Bilimsel	13-374-12
20G iğne	Bd	B305175
Kimmendil	Balıkçı Bilimsel	06-666A
Vidalı kapaklı kriyotüp	ThermoFisher Bilimsel	379189
Nunc 15 mL konik tüpler	ThermoFisher Bilimsel	12-565-268
Düşük protein bağlayıcı Eppendorf tüpleri	Eppendorf Belediyesi	22431081
3 mL şırınga	Bd	309657
Triflorasetik Asit (TFA)	Balıkçı Bilimsel	PI-28904
Asetonitril (ACN)	Balıkçı Bilimsel	A21-1
MilliQ su			Tüm çözeltileri ve tamponları hazırlamak için kullanılan deiyonize su

Serisi Serisi