Fosfopeptit Zenginleştirme: Spesifik Fosforile Peptitleri Kompleks Peptit Karışımlarından Ayırmak için Antikor Bazlı Bir İmmünopresipitasyon Tekniği

Özet

Kaynak: Cheng, L. C., et al. Prostat Kanserinde Fosfoproteomu Araştırmak İçin Etiketsiz Kantitatif Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş Fosfopeptit Zenginleştirme. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, bir peptit karışımından fosfopeptitlerin antikor bazlı immünopresipitasyonunu gösteriyoruz. Zenginleştirilmiş fosfopeptitler vakumla konsantre edilir ve aşağı akış analizi için depolanır.

Protokol

1. pY Peptitlerinin İmmünopresipitasyonu ve Zenginleştirilmesi

1. Saflaştırılmış peptit sindirimlerinin liyofilize tozunu, her fraksiyonda 0.5 mL buz gibi soğuk immünopresipitasyon (IP) bağlayıcı tampon ile yeniden süspanse edin. 0,5 mL yeniden süspansiyon hacmini ikinci fraksiyondan birinci fraksiyona aktararak fraksiyonları birleştirin ve pipet ucunu kaydedin. Numuneyi 3,6 mL vidalı kapaklı bir kriyotüpe aktarmadan önce tamamen çözüldüğünden emin olmak için kuvvetlice girdap (yukarı ve aşağı pipetlemek yerine).
2. Liyofilizasyon tüplerini her tüpte 0.5 mL başka bir IP bağlama tamponu (Tablo 1) ile durulayın. Numune kaybını en aza indirmek için aynı pipet ucunu kullanarak çözeltiyi 3,6 mL vidalı tüpe aktarın. Durulamayı 1 kez daha tekrarlayın, son resüspansiyon hacmini 2 mL yapın (5 mg protein için). Yaklaşık 7,4 olduğundan emin olmak için numune pH'ını ölçün. Çok asidik ise, yinelemeli olarak 10 μL 1M Tris (titre edilmemiş, pH ~ 11) ekleyin. Çok bazikse, yinelemeli olarak 10 μL seyreltik HCl (1:25 veya 1:100) ekleyin.
3. pY boncuklarını önceden yıkayın (5 mg başlangıç lizat için)
   1. Örnek başına 25 μg 4G10 antikoru ve 12.5 μg 27B10.4 antikoru gereklidir. Antikorları ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarmak için kesik uçlu bir p200 pipeti kullandıktan sonra, antikorları 450 μL buz gibi soğuk IP bağlayıcı tampon 2x ile yıkayın. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
   2. IP bağlama tamponu kullanarak boncukları 0,5 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. (Boncukları girdaplamayın.) Gerekli bulamacı (numune başına 50 μL 4G10 antikor bulamacı ve 25 μL 27B10.4 antikor bulamacı) tek bir tüpe ayırdıktan sonra, stok santrifüj tüplerini 200 x g'da 4 ° C'de 1 dakika boyunca döndürün. Boncukları buzdolabında saklamaya geri koymadan önce yan duvarları süpernatan ile yıkayın.
4. Vidalı kapaklı kriyotüplerde yeniden askıya alınmış numune çözeltisine önceden yıkanmış pY boncukları ekleyin. Gece boyunca uçtan uca bir döndürücüde 4 ° C'de inkübe edin.
5. Vidalı kriyotüpleri hassas bir mendille kaplı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Boncukları 1 dakika boyunca 100 x g'da döndürün. PST peptitlerini zenginleştirmek için kullanılacak süpernatanı kaydedin.
6. Boncukları 300 μL IP bağlama tamponu ile yeniden askıya alın. Bunları 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 1 dakika boyunca 100 x g'da döndürün.
7. İnkübasyon tüpünü 3x 200 μL IP bağlama tamponu ile durulayın. İçeriği her seferinde aynı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, onları aşağı doğru döndürün.
8. Boncukları mikrosantrifüj tüpünde 3x 500 μL IP bağlama tamponu ile yıkayın ve 1 dakika boyunca 100 x g'da döndürün. Daha sonra, boncukları 450 μL 25 μL NH₄HCO₃, pH 7.5 ile yıkayın ve 1 dakika boyunca 100 x g'da döndürün. Her seferinde tozdan taze bir 25 mM NH_4HCO3 çözeltisi kullanın.
9. Boncukları 1,500 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Jel yükleme ucunun ucunu boncukların yüzeyinin biraz altına daldırarak süpernatanı tamamen çıkarmak için bir jel yükleme ucu kullanın.
10. Boncuklara %0,1 TFA'lık boncuk hacminin 4 katını ekleyin (yani, 75 μg pY boncuk bulamacı için 300 μL %0,1 TFA ekleyin). Bunları iyice karıştırın ve karışımı 1.000 rpm'de bir termomikserde 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
11. Yeniden süspansiyonu 0,2 μm'lik bir sıkma filtresine aktarın. Elüsyon tüpünü hızlı bir şekilde döndürün ve kalan hacmi bir P10 pipeti kullanarak aynı döndürme filtresine aktarın. Sıkma filtresini 1 dakika boyunca 850 x g'da döndürün. Elüsyonu düşük protein bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Eluate'i gece boyunca 40 °C'de ve 300 dk.
    ısı süresinde kuruyana kadar vakumla konsantre edin not: Deney burada duraklatılabilir. Numuneleri -80 °C'de dondurun ve daha sonraki bir tarihte devam edin.

Tablo 1: Tamponlar ve çözeltiler.Bu tablo, bu protokolde kullanılan tamponların ve çözeltilerin bileşimlerini göstermektedir.

arabellek	hacim	kompozisyon
6 M Guanidinyum klorür lizis tamponu	50 mL	6 M guanidinyum klorür, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin, 40 mM kloroasetamid, 2 mM sodyum ortovanadat, 2.5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM β-gliserofosfat, 500 mg n-oktil-glikozit, ultra saf su hacmine
100 mM Sodyum pirofosfat	50 mL	2.23 g sodyum pirofosfat dekahidrat, hacimce ultra saf su
1M β-gliserofosfat	50 mL	15.31 g β-gliserofosfat, hacimce ultra saf su
% 5 Trifloroasetik asit	20 mL	19 mL ultra saf suya 1 mL %100 trifloroasetik asit ekleyin
% 0.1 Trifloroasetik asit	250 mL	245 mL ultra saf suya 5 mL %5 trifloroasetik asit ekleyin
pY elüsyon tamponu	250 mL	% 0.1 trifloroasetik asit,% 40 asetonitril, hacimce ultra saf su
pST elüsyon tamponu	250 mL	% 0.1 trifloroasetik asit,% 50 asetonitril, hacimce ultra saf su
IP bağlama arabelleği	200 mL	50 mM tris pH 7.4, 50 mM sodyum klorür, hacimce ultra saf su
25 mM Amonyum bikarbonat, pH 7.5	10 mL	19.7 mg'ı 10 mL steril ultra saf suya, 1 N hidroklorik asit (~ 10-15 μL / 10 ml çözelti) ile pH 7.5'e çözün, taze yapın
1M fosfat tamponu, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M sodyum dihidrojen fosfat, 577 mL 1 M sodyum hidrojen fosfat
Dengeleme tamponu	14 mL	6,3 mL asetonitril, 280 μL %5 trifloroasetik asit, 1740 μL laktik asit, 5,68 mL ultra saf su
Durulama tamponu	20 mL	9 mL asetonitril, 400 μL %5 trifloroasetik asit, 10,6 mL ultra saf su
Kütle spektrometresi çözümü	10 mL	500 μL asetonitril, 200 μL %5 trifloroasetik asit, 9,3 mL ultra saf su
Tampon A	250 mL	5 mM monopotasyum fosfat (pH 2.65), %30 asetonitril, 5 mM potasyum klorür, hacimce ultra saf su
Tampon B	250 mL	5 mM monopotasyum fosfat (pH 2.65), %30 asetonitril, 350 mM potasyum klorür, hacimce ultra saf su
% 0.9 Amonyum hidroksit	10 mL	300 μL %29,42 amonyum hidroksit, 9,7 mL ultra saf su

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Liyofilizatör	Laboratuvar Laboratuvarı	7420020
CentriVap Masaüstü Vakum Konsantratörü	Laboratuvar Laboratuvarı	7810010
Kimmendil	Balıkçı Bilimsel	06-666A
Milipore 0,2 μm sıkma filtresi	Kırlangıç Sigma	UFC30GVNB
Düşük protein bağlayıcı Eppendorf tüpleri	Eppendorf Belediyesi	22431081
anti-Fosfotirozin, Agaroz, Klon: 4G10	Kırlangıç Sigma	16101
27B10.4 antikoru	Hücre iskeleti	APY03 boncuklar
Peptit tahlil kiti	Termo Bilimsel	23275
Üst İpucu	PolyLC A.Ş	TT200TIO,96
SCX sütunları (PolySULFOETHYL A)	PolyLC A.Ş	SPESE1203
3 mL şırınga	Bd	309657
MilliQ su			Tüm çözeltileri ve tamponları hazırlamak için kullanılan deiyonize su
Triflorasetik Asit (TFA)	Balıkçı Bilimsel	PI-28904
Asetonitril (ACN)	Balıkçı Bilimsel	A21-1
Potasyum Klorür	Balıkçı Bilimsel	BP366-500
Laktik asit	Sigma-Aldrich	69785-250 ML
Amonyum Hidroksit	Balıkçı Bilimsel	A669S-500
Tris Tabanı	Balıkçı Bilimsel	BP152-5

. . Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi