Method Article

Fosfopeptitlerin Titanyum Dioksit Bazlı Zenginleştirilmesi: Peptit Kütüphanesinden Fosfopeptitlerin Seçici İzolasyonu İçin Bir Yöntem

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Cheng, L. C. et al. Prostat Kanserinde Fosfoproteomu Araştırmak için Etiketsiz Kantitatif Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş Fosfopeptit Zenginleştirme. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, prostat tümörü dokusundan ekstrakte edilen fosfopeptitlerin titanyum dioksit bazlı zenginleştirilmesini göstermektedir. Bu zenginleştirilmiş fosfopeptitler, prostat kanserinin ilerlemesinde rol oynayan hücre sinyal yollarını anlamak için protein karakterizasyonu gibi aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. pY Peptitlerin Titanyum Dioksit Zenginleştirilmesi

  1. Kurumuş fosfopeptitleri 200 μL% 50 ACN,% 0.1 TFA içinde yeniden süspanse edin. Vorteksleyin ve 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. İyi bir şekilde yeniden askıya almak için bu 1x'i tekrarlayın.
  2. 200 μL numune kapasitesine sahip uçlarda bulunan TiO2 boncuklarının hazırlanması.
    1. Malzemeyi o uca taşımak için ucun küçük uç tarafına hafifçe vurun. 200 μL %100 ACN ekleyerek ucu durulayın, ardından ucu ters çevirin ve sıvıyı kapağa doğru hareket ettirmek için küçük ucu hafifçe vurun.
    2. Bir tıraş bıçağı kullanarak, ucun küçük ucunu kesin ve düşük protein bağlayıcı bir tüpün üzerine yerleştirin. (TiO2 tüpün yanlarına yapışacağı için polistiren tüpleri kullanmaktan kaçının.) Kapağı çıkarın ve kalan ACN'yi dışarı atmak için bir mikropipet yerleştirin. Yıkamayı 200 μL% 100 ACN ile tekrarlayın. TiO2 boncukları şimdi aşağıdaki adımlar için düşük protein bağlayıcı tüpte bulunur.
    3. 500 μL %100 ACN 2x ile ön koşul TiO 2. Boncukları çözücü ile karıştırmak için pipetleyin. 1 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
    4. Durum TiO2, 500 μL 0.2 M sodyum fosfat tamponu (pH ~ 7) 2x. Boncukları 300 μL dengeleme tamponu 3x ile yıkayın. TiO2 çok yoğun olduğu için boncuklar hızlı bir şekilde yerleşir.
  3. Düşük protein bağlayıcı tüpe 400 μL %50 ACN, %0.1 TFA ekleyin, ardından 84 μL laktik asit ekleyin. Yeniden süspanse edilmiş fosfopeptitleri düşük protein bağlayıcı tüpe aktarın ve uçtan uca döndürücü kullanarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  4. Boncukları pelet yapmak için 1 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. 300 μL dengeleme tamponu (Tablo 1) 2x ile yıkayın ve 100 x g'da 1 dakika döndürün.
  5. Boncukları 300 μL durulama tamponu 2x ile durulayın. Bunları 0,2 μm döndürme filtresine aktarın. 1,500 x g'da 1 dakika döndürün.
  6. Filtre ünitesini temiz, 1,5 mL'lik düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın. H₂O'da 200 μL %0,9 NH₃ ile içeriği 2x elute. PH'ı 10 ile 11 arasında olması gereken pH şeritleri ile ölçün. Amonyağı buharlaştırmak için eluatı gece boyunca kurumaya bırakın.

Tablo 1: Tamponlar ve çözeltiler.Bu tablo, bu protokolde kullanılan tamponların ve çözeltilerin bileşimlerini göstermektedir.

arabellekhacimkompozisyon
6 M guanidinyum klorür lizis tamponu50 mL6 M guanidinyum klorür, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin, 40 mM kloroasetamid, 2 mM sodyum ortovanadat, 2.5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM β-gliserofosfat, 500 mg n-oktil-glikozit, ultra saf su hacmine
100 mM sodyum pirofosfat50 mL2.23 g sodyum pirofosfat dekahidrat, hacimce ultra saf su
1M β-gliserofosfat50 mL15.31 g β-gliserofosfat, hacimce ultra saf su
% 5 trifloroasetik asit20 mL19 mL ultra saf suya 1 mL %100 trifloroasetik asit ekleyin
% 0.1 trifloroasetik asit250 mL245 mL ultra saf suya 5 mL %5 trifloroasetik asit ekleyin
pY elüsyon tamponu250 mL% 0.1 trifloroasetik asit,% 40 asetonitril, hacimce ultra saf su
pST elüsyon tamponu250 mL% 0.1 trifloroasetik asit,% 50 asetonitril, hacimce ultra saf su
IP bağlama arabelleği200 mL50 mM tris pH 7.4, 50 mM sodyum klorür, hacimce ultra saf su
25 mM amonyum bikarbonat, pH 7.510 mL19.7 mg'ı 10 mL steril ultra saf suya, 1 N hidroklorik asit (~ 10-15 μL / 10 ml çözelti) ile pH 7.5'e çözün, taze yapın
1M fosfat tamponu, pH 71.000 mL423 mL 1 M sodyum dihidrojen fosfat, 577 mL 1 M sodyum hidrojen fosfat
Dengeleme tamponu14 mL6,3 mL asetonitril, 280 μL %5 trifloroasetik asit, 1740 μL laktik asit, 5,68 mL ultra saf su
Durulama tamponu20 mL9 mL asetonitril, 400 μL %5 trifloroasetik asit, 10,6 mL ultra saf su
Kütle spektrometresi çözümü10 mL500 μL asetonitril, 200 μL %5 trifloroasetik asit, 9,3 mL ultra saf su
Tampon A250 mL5 mM monopotasyum fosfat (pH 2.65), %30 asetonitril, 5 mM potasyum klorür, hacimce ultra saf su
Tampon B250 mL5 mM monopotasyum fosfat (pH 2.65), %30 asetonitril, 350 mM potasyum klorür, hacimce ultra saf su
% 0.9 amonyum hidroksit10 mL300 μL %29,42 amonyum hidroksit, 9,7 mL ultra saf su

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Vakum manifolduRestek26080
LiyofilizatörLaboratuvar Laboratuvarı7420020
CentriVap Masaüstü Vakum KonsantratörüLaboratuvar Laboratuvarı7810010
Uçtan uca döndürücüThermoFisher Bilimsel415110Q
Tıraş bıçağıBalıkçı Bilimsel620177
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre ÜniteleriKırlangıç SigmaUFC901024
Nunc 15 mL konik tüplerThermoFisher Bilimsel12-565-268
Milipore 0,2 μm sıkma filtresiKırlangıç SigmaUFC30GVNB
Düşük protein bağlayıcı Eppendorf tüpleriEppendorf Belediyesi22431081
anti-Fosfotirozin, Agaroz, Klon: 4G10Kırlangıç Sigma16101
Peptit tahlil kitiTermo Bilimsel23275
Triflorasetik Asit (TFA)Balıkçı BilimselPI-28904
Asetonitril (ACN)Balıkçı BilimselA21-1
Laktik asitSigma-Aldrich69785-250 ML
Amonyum HidroksitBalıkçı BilimselA669S-500
Potasyum Fosfat MonobazikBalıkçı BilimselBP362-500
Potasyum KlorürBalıkçı BilimselBP366-500
Kalsiyum Klorür DihidratBalıkçı BilimselBP510-500
Tris TabanıBalıkçı BilimselBP152-5
Tek UçluPolyLC A.ŞTT200TIO,96
Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi .

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Titanium DioxidePhosphopeptide EnrichmentPeptide LibraryBinding BufferCentrifugationSpin FilterAmmonia ElutionPhosphopeptide IsolationProstate CancerMass Spectrometry

Related Articles