Genetik Olarak Tasarlanmış Fare Modellerinde Prostat Kanserinin Modellenmesi: Fare Ön Prostat Lob Hücrelerinde CRISPR/Cas9 Aracılı Lokalize Gen Düzenleme Tekniği

Abstract

Kaynak: Riedel, M. et al. CRISPR'ın Gen Değişikliği için Murin Prostatına Virüs İletimi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, adenovirüs tabanlı bir dağıtım sistemi kullanarak prostat bezi hücrelerindeki belirli genleri düzenlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım, prostat kanseri için yeni fare modelleri geliştirmek için CRISPR teknolojisini kullanarak gen ekspresyonunun ortotopik ve lokalize değiştirilmesine izin verir.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Murin Prostatına virüs iletimi

1. Steril 1 mL şırınga ve 27G x 1/2 "iğne ile intraperitoneal enjeksiyon ile hayvanı uyuşturun. Vücut ağırlığında 0.01 mL / g anestezi dozu kullanın. İşlem 30 dakikadan uzun sürerse, her 30 dakikada bir başlangıç dozunun 1 / 3'ünü enjekte ederek anesteziyi koruyun.
2. Kas gevşemesini, pedal çekilmesini ve palpebral refleksleri değerlendirerek anestezik derinliği inceleyin. Refleks kaybı gözlendiğinde, hayvanın alt karnını tıraş edin.
3. Kornea refleksi eksikliğinden kaynaklanan körlüğü önlemek için steril bir pamuklu çubuk kullanarak hayvanın gözlerini veteriner oftalmik merhem ile dikkatlice örtün.
4. Cerrahi bölgeyi dezenfekte etmek için traş edilmiş karnı %70 etanol ve %10 povidon-iyot ile silin. Cerrahi alanı, cerrahi alanın merkezinden çevreye doğru ovalayın.
5. Steril bir cerrahi makas kullanarak alt karın orta hattında yaklaşık 1 cm'lik dikey bir cilt kesisi yapın.
6. Altında yatan organlara zarar vermemek için ince uçlu forseps kullanarak peritonu kaldırın. Karın zarından cerrahi makas kullanarak dikkatlice <8 mm'lik bir kesi yapın.
   NOT: İnsanların aksine, bir kemirgenin prostat bezi dört ayrı lobdan oluşur. Ön lob seminal veziküle bağlanır.
7. Seminal vezikülü ortaya çıkarmak için yağ dokusunu nazikçe kenara çekin. Bir halka forseps kullanarak, ön prostat tanımlanana kadar seminal vezikülü dikkatlice kaldırın (Şekil 1).
8. 30G x 8 mm'lik bir iğne ile 0,5 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak ön prostat epiteline toplam hacimde 30 μL virüs (3 x 10¹⁰ viral parçacık) çözeltisi enjekte edin. Sızıntıyı en aza indirin ve sıvının doku içinde emilerek küçük bir baloncuk oluşturduğundan emin olun. Seminal vezikülü karın boşluğuna geri yerleştirin.
9. 13 mm, 3/8 daire ve konik uçlu iğne ile 6-0 emilebilir sütür kullanarak 2-3 basit kesikli dikişle karın zarını dikin.
10. Peritona zarar vermemek için cildi forseps ile kaldırarak üç steril 4,8 x 6,5 mm klipsle cildi zımbalayın.
11. Daha iyi iyileşme için, anestezi panzehirini steril 1 mL şırınga ve 27G x 1/2 "iğne kullanarak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 0.01 mL / g vücut ağırlığı dozunda uygulayın. Hayvanı dikkatlice kafesine geri yerleştirin.

Results

Şekil 1: Prosedürün gösterimi. İşlem, Platt ve arkadaşları tarafından oluşturulan Rosa26-LSL-Cas9-EGFP faresinde gerçekleştirilir. Anterior prostat (AP) seminal veziküle (SV) bağlanır. Gen ekspresyonunu değiştirmek için kılavuz RNA ve bir Cre proteini eksprese eden virüs parçacıkları ön prostata enjekte edilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J fareler	Jackson Laboratuvarı	26175
0,5 ml U-100 insülin şırıngası	Bd	324825	virüs enjeksiyonu için
1 ml şırınga	Bd	300013	anestezi enjeksiyonu için
30 G 1/2'' iğne	Bd	304000	anestezi enjeksiyonu için
6-0 Polisorb Sütür	Medtronic Bilişim A.Ş.	GL889	karın zarını kapatmak için
Tek kullanımlık sterilize cerrahi örtü	Birden fazla tedarikçi
Isıtma yastığı	Birden fazla tedarikçi
Povidon-İyot Hazırlama Pedi	Balıkçı Bilimsel	06-669-70
Kırpma makinesi	Aesculap Belediyesi	GT415	Karın tıraşı olmak
Dumont Forseps	F.S.T	11252-00
Halsey Mikro İğne Tutucu	F.S.T	12500-12
İris Makası	F.S.T	14094-11
Dar Desen Forseps	F.S.T	11002-12
Yüzük Forseps	F.S.T	11106-09
Yara Klipsi Sistem Kolu, dahil Klip -leri	F.S.T	12030-01	cildi kapatmak için
Yara Klipsi Sistem Sökücü	F.S.T	12030-04
1 adet PBS	Gibco (Gibco)	10010-023
Antisedan			Hayvan tesisinden elde edildi
Öksüzol			Hayvan tesisinden elde edildi
Medetomidinhidroklorid			Hayvan tesisinden elde edildi
Midazolam			Hayvan tesisinden elde edildi
%100 Etanol	Balıkçı Bilimsel	22-032-103
Göz merhemi	Takeda Belediyesi	7242
Virüs (AAV, AV)	Birden fazla tedarikçi		Bu protokolde kullanılan virüs şirket içi bir üretimdir