Genomik DNA'nın Bisülfit Dönüşümü: Gastrointestinal Kanser Dokusundan Alınan Genomik DNA Örneklerinde DNA Metilasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Bonetto, A. et al. Kanser Kaşeksi Çalışması için Bir Model Olarak Kolon-26 Karsinom Tümörü Taşıyan Fare. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, gastrointestinal kanser örneklerinden genomik DNA'nın bisülfit modifikasyonu prosedürünü göstermektedir. Teknik, genlerin metilasyon paternleri arasındaki ilişkiyi araştırmak ve karsinogeneze katkılarını belirlemek için faydalıdır.

Protokol

1. Bisülfit Tedavisi

1. Örnek olarak 45 μL sindirilmiş doku çözeltisi kullanın.
2. Bisülfit işlemini, üreticinin talimatlarına göre bir bisülfit dönüştürme kitindeki reaktifleri kullanarak gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. DNA örneğine 5 μL seyreltme tamponu ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   2. Numuneler inkübe edilirken, bir tüp CT dönüşüm reaktifine 750 μL_dH2Ove 210 μL seyreltme tamponu ekleyerek bisülfit dönüşüm reaktifini hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Tüpleri 10 dakika girdaplayarak karıştırın.
   3. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, her numuneye 100 μL hazırlanan CT dönüşüm reaktifi ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.
   4. Numuneleri karanlıkta 50 °C'de 12 ila 16 saat inkübe edin.
   5. İnkübasyondan sonra numuneleri çıkarın ve 10 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
   6. 400 μL bağlayıcı tampon ekleyin ve her bir numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın (Malzeme Tablosuna bakın). Her numuneyi bir döndürme kolonuna yükleyin ve kolonu 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   7. Her numuneyi 1 dakika boyunca tam hızda (10.000 x g) santrifüjleyin ve akışı atın.
   8. Her sütuna 200 μL yıkama tamponu ekleyin ve akışı atarak 1 dakika boyunca tam hızda döndürün (Malzeme Tablosuna bakın).
   9. Her kolona 200 μL desülfonasyon tamponu ekleyin ve kolonun oda sıcaklığında 15 dakika beklemesine izin verin (bkz. Malzeme Tablosu). İnkübasyondan sonra, sütunları 1 dakika boyunca tam hızda döndürün ve akışı atın.
   10. Her sütuna 200 μL yıkama tamponu ekleyin ve 1 dakika boyunca tam hızda döndürün (Malzeme Tablosuna bakın).
   11. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
   12. Her sütuna 46 μL dH₂O ekleyin ve her sütunu yeni bir steril 1.5 mL tek kullanımlık polipropilen tüpe yerleştirin (bkz. DNA'yı ortaya çıkarmak için her tüpü 2 dakika döndürün.
3. Her bir döndürme sütununu tek kullanımlık polipropilen tüpten çıkarın ve atın (Malzeme Tablosuna bakın). DNA artık analiz için hazırdır.

2. Kantitatif Metilasyona Özgü PCR (qMSP)

1. Her gen analizinde promotör bölgenin metilasyonunu değerlendirmek için qMSP'de floresan tabanlı gerçek zamanlı PCR için bir şablon olarak adım 1.3'teki bisülfit ile modifiye edilmiş DNA'yı kullanın.
2. 96 oyuklu bir Real-Time PCR cihazı kullanarak qMSP gerçekleştirin (bkz.
   1. 200 nM ileri primer, 200 nM ters primer ve 80 nM prob kullanarak bisülfit ile modifiye edilmiş DNA üzerindeki hedef genin promotör metilasyon durumunu kontrol edin. Ana karışımı 16.6 mM (NH₄)₂SO₄, 67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-merkaptoetanol, 10 nM floresein, her bir deoksinükleotid trifosfattan 0.166 mM ve 0.04 U/μl DNA polimeraz ile hazırlayın (bkz. Tüm tahliller için her bir oyuktaki son reaksiyon hacmi 25 μL'dir.
   2. qMSP'nin döngüsünü şu şekilde gerçekleştirin: 5 dakika boyunca 95 ° C, ardından 15 saniye boyunca 95 ° C, 1 dakika boyunca 60 ° C ve 1 dakika boyunca 72 ° C döngüsü
      NOT: Hedef gen, daha büyük beta değerlerine sahip olması, promotör bölgesindeki CpG adaları ile ilişkili olması ve qMSP için primer ve prob tasarımına uygun olması kriterlerine göre seçilmelidir.
3. Pozitif metilasyon kontrolü olarak CpG Metilaz (M.SssI) ile muamele edilmiş insan genomiğini kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   not: Metilasyonun nihai miktar tayini, nispi metilasyon değeri (RMV) olarak tanımlanır ve β-Aktin (ACTB) için ortalama Ct'ye kıyasla her metilasyon algılama replikasyonu için ^2-ΔΔCt olarak hesaplanır. Primer ve prob dizileri Tablo 1'de gösterilmiştir. Algılanmayan replikalar için 100'lük bir Ct kullanılır, bu da sıfıra yakın 2^–ΔΔCt değeri verir. Aşağıdaki formül kullanılır:
   ortalama 2^–ΔΔCt (RMV) = (2^–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.

gen	İleri 5' - 3'	Ters 5' - 3'	sonda
B-AKTİN	ETIKET: GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT	AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC	\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT ETIKETI \3IABkFQ\
EPB41L3	GGG ATA GTG GGG TTG ACG C	ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA	AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	14148
% 10 Sodyum dodesil sülfat (SDS)	351-032-721 EA
%100 Etanol	Sigma-Aldrich	24194
ABI StepOnePlus Gerçek Zamanlı PCR Sistemi	Uygulamalı Biyosistemler	4376600	96 kuyulu Gerçek Zamanlı PCR cihazı
CT dönüşüm reaktifi	Zymo Araştırma	D5001-1
Deoksinükleotid trifosfat (dNTP)	Canlandırıcı	10297-018
DEPC ile arıtılmış su	DEPC ile arıtılmış su	351-068-131
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Corning	46-034-CL
EZ DNA Metilasyon Kiti	Zymo Araştırma	D5002
İnsan genomik DNA'sı	New England Biyo Laboratuvarları	N4002S Serisi
Infinium İnsan Metilasyonu 450 testi	Illumina Belediyesi	ÇG-314	Genomdaki >450.000 CpG bölgesinin metilasyon durumunu değerlendirmek için DNA metilasyonunun karmaşık değerlendirmesi için dizi platformu
Işık Döngüleyici 480	Roche	5015278001
M-Bağlama Tamponu	Zymo Araştırma	D5002-3
M-Desülfonasyon Tamponu	Zymo Araştırma	D5002-5
M-Seyreltme Tamponu	Zymo Araştırma	D5002-2
M-Yıkama Tamponu	Zymo Araştırma	D5002-4
Proteinaz K	New England Biyolojik Laboratuvarları	P8107S Serisi
Tek kullanımlık polipropilen (Eppendorf) tüp	Eppendorf Belediyesi	24533495
Tris hidroklorür (Tris-HCL) 2 M pH 8.8	Kalite Biyolojik	351-092-101
Zymo Spin 1 Sütun	Zymo Araştırma	C1003
β-Merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Floresan	Biyo-Rad	#1708780
Platin Taq polimeraz	ThermoFisher Bilimsel	10966-034